發(fā)布時間：2017-04-17 13:25

  本文關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化及其蛋白質(zhì)組學研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的：瘧原蟲屬于真球蟲目,血孢子蟲亞目,瘧原蟲科,寄生于人體可以引起人類瘧疾。尤其是惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum),與75%的人類瘧疾有關(guān)[1],瘧疾流行于102個國家和地區(qū)導致4億人感染,雖然大多數(shù)患者能夠治愈,可是仍有100萬人死亡,其中以兒童占了多數(shù)。至今我國仍有約15個省(自治區(qū))546個縣(市)近3億人口還在瘧疾威脅之中,南部惡性瘧病例增多,因此,瘧疾的防治在傳染性疾病中仍然居于重要地位[3]。以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ACT)是目前治療惡性瘧疾這一最致命的疾病形式最強有力的武器,其療效能達到90%以上[4,5],但近年來科學家們發(fā)現(xiàn)少數(shù)惡性瘧原蟲對青蒿素、氯喹等藥物表現(xiàn)出抗藥性,在部分東南亞地區(qū)日益嚴重在柬埔寨和泰國邊境地區(qū)近期已確認出現(xiàn)青蒿素耐藥性,這為瘧疾的防治工作敲響了警鐘。開發(fā)抗瘧疾新藥不但至關(guān)重要而且面臨著急迫性。為了找到新的抗瘧藥物作用靶標,我們須進一步研究瘧原蟲的結(jié)構(gòu)及其特性,以找到有效的藥物作用靶點,為研究抗瘧新藥提供基礎(chǔ)。寄生蟲體內(nèi)許多特殊的細胞器是寄生蟲特有的,是宿主體內(nèi)不存在的,通過對這些細胞器的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究,就有可能發(fā)現(xiàn)針對這些寄生蟲的特異靶標。近期研究發(fā)現(xiàn)并命名的一個新細胞器一酸性鈣體(Acidocalcisome, Ac)就是其中之一。酸性鈣體是一種特殊的細胞器,由美國伊利諾依大學Dr.Docampo Roberto教授的研究團隊首先在錐蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn),因其富含鈣和磷酸鹽,呈酸性,故命名為酸性鈣體。隨后又在利什曼原蟲、弓形蟲、瘧原蟲、艾美原蟲、綠藻、霉菌、細菌、卵黃及人類血小板中均發(fā)現(xiàn)有該類細胞器的存在。相對于大家所熟知的細胞器,這種新近發(fā)現(xiàn)的細胞器為我們研究抗瘧新藥提供了更大可能性。研究發(fā)現(xiàn),酸性鈣體的膜上有許多泵：如鈣泵(Ca2+-ATPase)、質(zhì)子泵(Vacuolar-H+-ATPase, Vacuolar-H+-pryophosphatase)、鈉/氫泵(Na+/H+ exchanger)、鈣/氫泵(Ca2+/H+ exchanger)和水蛋白通道(Aquaporin)、離子通道等。其中,液泡型質(zhì)子焦磷酸酶為酸性鈣體所特有,已被應用為酸性鈣體分離純化及定位的標志。這些蛋白為酸性鈣體的主要生理功能奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。酸性鈣體的主要功能有4個：儲存磷酸鹽,儲存陽離子,調(diào)節(jié)pH值和調(diào)節(jié)滲透壓。這些成分對寄生蟲的毒性、代謝和入侵宿主具有非常重要的作用。在對寄生蟲酸性鈣體的研究中,以錐蟲和弓形蟲的研究最為深入,瘧原蟲中也已證實有酸性鈣體的存在[18-20],但對其研究遠不如錐蟲和弓形蟲深入,其具體的結(jié)構(gòu)、生物學功能和代謝特點尚未十分清楚。為了找到更多可作為抗瘧新藥靶標的蛋白,我們需要對惡性瘧原蟲酸性鈣體進行蛋白質(zhì)組學分析。研究方法與結(jié)果：用傳統(tǒng)方法從惡性瘧原蟲中分離、純化酸性鈣體非常困難。因為惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)時,其生長過程受血清影響很大,很難標準化,因此很難獲得足夠量的蟲體。本課題組在長期的惡性瘧原蟲相關(guān)研究過程中,建立了利用AlbuMAXⅠ替代人血清培養(yǎng)惡性瘧原蟲的方法,體外連續(xù)培養(yǎng)紅細胞感染率最高可以達到40%。該方法已證明能滿足大規(guī)模分離、純化蟲體的需求,可提供充足的蟲源。在紅細胞感染率達到20%時,收集蟲血,經(jīng)60%的Percoll分離純化感染紅細胞后,用皂素室溫條件下溫和裂解紅細胞,得到純化的惡性瘧原蟲滋養(yǎng)體和裂殖體。細胞裂解液配合碳化硅碾磨裂解蟲體之后,收集勻漿上清。本實驗室在前期對伯氏瘧原蟲酸性鈣體進行研究時,摸索出適合分離純化伯氏瘧原蟲酸性鈣體的碘克沙醇密度梯度為15%、20%、25%、30%、34%和38%,相對離心力30000g。我們將相對離心力調(diào)整為50000g后,發(fā)現(xiàn)該梯度同樣適合惡性瘧原蟲酸性鈣體的提取,離心管內(nèi)溶液分為13層,酸性鈣體被富集于最底層沉淀中。將最底層沉淀重懸后進行透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)其中含有豐富的大小不等的圓形電子致密顆粒,對純化的惡性瘧原蟲感染紅細胞樣本經(jīng)制片處理后進行透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)蟲體中有散在分布的大小不等空泡或包涵體。這些均與前人文獻報道相符,由此認為,本研究成功將惡性瘧原蟲酸性鈣體提取純化。將純化的惡性瘧原蟲酸性鈣體樣品裂解、濃縮、電泳后,割膠進行液相色譜(LC-MS/MS)鑒定。通過Mascot2.3.02軟件對鑒定得到的肽段進行分析比對,,我們共得到283個鑒定蛋白質(zhì),其中77個為假想蛋白質(zhì),62個為惡性瘧原蟲保守蛋白,144個為已識別蛋白質(zhì)。對鑒定到的蛋白進行GO功能分析注釋,我們發(fā)現(xiàn),在分子功能(Molecular Function)分類結(jié)果中,催化活性蛋白(catalytic activity)和結(jié)合活性蛋白(binding activity)占絕大多數(shù),分別為33.33%和55.56%；亞細胞定位(Cellular Component)結(jié)果顯示,16.67%的鑒定蛋白質(zhì)位于細胞器；參與生物進程(Biological Process)分類結(jié)果顯示,16.47%鑒定蛋白質(zhì)主要參與新陳代謝過程(metabolic process)、16.47%參與細胞過程(cellular process)、12.50%參與單一生物過程(single-organism　process)、將鑒定到的蛋白質(zhì)和COG數(shù)據(jù)庫進行比對,預測這些蛋白質(zhì)大部分可能與能量生產(chǎn)及轉(zhuǎn)換(Energ production and conversion)、細胞內(nèi)交通、分泌及膜泡轉(zhuǎn)運(Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport)和預測一般功能(General function prediction only)有關(guān)。這些特征與酸性鈣體的四個主要功能相關(guān)。通過文獻檢索及生物學分析,最后初步預測液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(V-PPase)、磷酸核糖焦磷酸合成酶、磷酸化型Ca2+ATP酶、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運體蛋白、小GTP結(jié)合蛋白sar1、鈣依賴性蛋白激酶4 (CDPK4)、14-3-3蛋白家族、水甘油通道蛋白(AQP)、液泡型質(zhì)子ATP酶、囊泡相關(guān)膜蛋白、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶、液泡型ATP合成酶等17個蛋白質(zhì)可能定位于惡性瘧原蟲酸性鈣體。本實驗室在對伯氏瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)組學的研究中,初步預測了水通道蛋白、CCR4相關(guān)因子16、鈣依賴性蛋白激酶4(CDPK4)、多重耐藥蛋白(MRP)、液泡型ATP合成酶亞單位(a,b,c,h,f)、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶、磷脂酰肌-3酶、磷脂酶A2 (PLA2s)和液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(V-PPase)等18個蛋白定位于酸性鈣體。因伯氏瘧原蟲跟惡性瘧原蟲在形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組成、生理特點、生長周期等方面非常相似,因此,伯氏瘧原蟲酸性鈣體的蛋白質(zhì)組學研究對于本實驗具有一定的指導意義。通過將惡性瘧原蟲酸性鈣體的17個預測蛋白和伯氏瘧原蟲酸性鈣體的18個預測蛋白進行對比分析,我們發(fā)現(xiàn)了8個蛋白在惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲酸性鈣體中均被預測有存在的可能。通過用ClustalW2對這8個蛋白進行同源性比對,發(fā)現(xiàn)其中有7個蛋白同源性較高,大于60%。大量閱讀相關(guān)文獻并綜合以上分析后,我們選擇惡性瘧原蟲水甘油通道蛋白(PfAQP)作進一步的研究,同時我們需要惡性瘧原蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(PfVP1)的抗體做共定位研究。因其二者跨膜區(qū)均較多,不易進行原核表達,多次嘗試均以失敗告終,故我們選擇利用合成肽與載體蛋白偶聯(lián)作抗原免疫小鼠的方法制備單克隆抗體。為了后續(xù)研究的開展,我們將弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(TgVP1)的氨基酸序列與PfVP1作比對,選擇其同源序列合成肽段制備單抗,PfAQP單抗制備則選擇PfAQP與伯氏瘧原蟲水通道蛋白(PbAQP)的同源肽段進行合成。惡性瘧原蟲水通道蛋白(PfAQP)全長258個氨基酸,大小約為28kDa,弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(TgVP1)全長816個氨基酸,大小約為85kDa。針對PfAQP,經(jīng)過IEBD、BCPREDS Server 1.0、TMHMM Server v 2.0和同源性比對分析,我們在PfAQP的6個跨膜區(qū)之外選擇了與惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲同源性較高的肽段,CPLVDLANNEKDGVDL,位于肽鏈全長的C端243～258個氨基酸。用這種方法我們最終獲得2C3和6H10兩株單抗,這兩株單抗不僅能與人工合成的多肽反應,而且可以識別天然惡性瘧原蟲蛋白中的27kDa大小蛋白,與PfAQP預測大小及文獻報道相符[37]。而針對TgVPl,我們利用IEBD、TMHMM Server v 2.0和同源性比對分析后,選擇了其17個跨膜區(qū)外并與瘧原蟲同源性較高的肽段,用這種方法我們最終獲得單抗1D7-H11、3A6-E4和3G6-F9,這3株單抗均可以識別天然弓形蟲全蛋白中85kDa大小和惡性瘧原蟲全蛋白中76kDa大小蛋白。進行免疫熒光鑒定時,以上5株單抗均能產(chǎn)生特異性熒光,但PfAQP與TgVPl的熒光能否共定位仍需進一步驗證。結(jié)論：本研究建立了AlbuMAX I替代人血清體外連續(xù)培養(yǎng)惡性瘧原蟲的方法,收集到足夠蟲體,成功分離純化出惡性瘧原蟲酸性鈣體并進行了蛋白質(zhì)組學分析,鑒定獲得283個蛋白質(zhì),經(jīng)系統(tǒng)生物信息學分析初步預測有17個蛋白質(zhì)可能定位于惡性瘧原蟲酸性鈣體,并成功制備了2株惡性瘧原蟲水甘油通道蛋白抗體和3株弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶抗體,經(jīng)鑒定,這5株抗體均可與目的蛋白特異性結(jié)合,且抗弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶抗體可與惡性瘧原蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶特異性結(jié)合。以上實驗結(jié)果為惡性瘧原蟲酸性鈣體的相關(guān)研究及抗瘧新藥作用靶標的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：惡性瘧原蟲 酸性鈣體 蛋白質(zhì)組學 lc-ms/ms 單克隆抗體 免疫熒光
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R382
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 第一章 惡性瘧原蟲的復蘇、體外培養(yǎng)及分離純化20-29
• 1. 材料20-24
• 2. 方法24-26
• 3. 結(jié)果26-28
• 4. 小結(jié)28-29
• 第二章 惡性瘧原蟲酸性鈣體的純化提取和電鏡觀察29-37
• 1. 材料29-31
• 2. 方法31-34
• 3. 結(jié)果34-36
• 4. 小結(jié)36-37
• 第三章 惡性瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)組學分析37-45
• 1. 材料37-38
• 2. 方法38-41
• 3. 結(jié)果41-44
• 4. 小結(jié)44-45
• 第四章 惡性瘧原蟲酸性鈣體相關(guān)蛋白單克隆抗體的制備及鑒定45-66
• 1. 材料45-49
• 2. 方法49-56
• 3. 結(jié)果56-64
• 4. 小結(jié)64-66
• 討論66-74
• 參考文獻74-81
• 英文縮寫詞81-83
• 碩士期間科研成果83-84
• 致謝84-85

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 車河龍;林棟;;瘧疾的防控現(xiàn)狀及進展[J];熱帶醫(yī)學雜志;2010年02期

  本文關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化及其蛋白質(zhì)組學研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：313332