背景:端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶是一種重要的調(diào)控細(xì)胞分化增殖的酶,其具有多種生物活性。研究表明,經(jīng)過(guò)h TERT基因修飾后可能有利于提高甲狀旁腺細(xì)胞增殖能力的存活能力和功能,能夠起到對(duì)甲狀旁腺細(xì)胞體外培養(yǎng)的優(yōu)化作用。目的:用負(fù)載h TERT目的基因的反轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN轉(zhuǎn)染大鼠甲狀旁腺細(xì)胞,觀察細(xì)胞生物學(xué)特性及細(xì)胞分泌功能變化,以探討甲狀旁腺細(xì)胞培養(yǎng)更為優(yōu)化的方法。方法:28只雄性Wistar大鼠,由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供,經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為2017-0652）。大鼠麻醉后切取甲狀旁腺并通過(guò)病理學(xué)確認(rèn),用膠原酶Ⅱ消化獲得甲狀旁腺細(xì)胞,并經(jīng)過(guò)Westernblot檢測(cè)鈣敏感性受體、甲狀旁腺激素和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失轉(zhuǎn)錄因子（GCM-2）進(jìn)行鑒定。將鑒定后細(xì)胞分為正常的甲狀旁腺細(xì)胞組、空病毒組和h TERT轉(zhuǎn)染組。h TERT轉(zhuǎn)染后3d,通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中h TERT基因和蛋白相對(duì)表達(dá);應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和CCK-8法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況;采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布;使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞的上清液中甲狀旁腺激素的濃度變化... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)組織工程研究. 2019,23(25)北大核心

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【部分圖文】：

甲狀旁腺細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)水平Figure2Levelsofsurfacemarkersofparathyroidcellsβ-actin

赴??で?嘸跋赴?鮒郴钚?與正常的甲狀旁腺細(xì)胞和含有空載病毒的細(xì)胞相比，hTERT基因轉(zhuǎn)染顯著提高了甲狀旁腺細(xì)胞的增殖活性，差異有顯著性意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法繪制了甲狀旁腺細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。hTERT基因轉(zhuǎn)染組中甲狀旁腺細(xì)胞的增殖活性在培養(yǎng)72h后顯著快于正常對(duì)照組和空載病毒組中的細(xì)胞增殖速度，差異有顯著性意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。圖注：圖A為細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)天；B為細(xì)胞培養(yǎng)2d；C為細(xì)胞培養(yǎng)3d。經(jīng)過(guò)鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為甲狀旁腺細(xì)胞的主細(xì)胞。圖1大鼠甲狀旁腺細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)(×40)Figure1Morphologyofratparathyroidcells(×40)表1甲狀旁腺細(xì)胞特異性標(biāo)記物不同時(shí)間表達(dá)(x_±s，n=3)Table1Specialmarkersofparathyroidcellsatdifferenttime時(shí)間鈣敏感性受體甲狀旁腺激素神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失轉(zhuǎn)錄因子7d0.51±0.070.64±0.050.49±0.0614d1.18±0.12a1.10±0.10a1.23±0.11a21d1.66±0.14ab1.82±0.17ab1.79±0.18ab表注：與7d時(shí)比較，aP<0.05；與14d時(shí)比較，bP<0.05。7d14d21d鈣敏感性受體甲狀旁腺激素神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失轉(zhuǎn)錄因子β-actin圖2甲狀旁腺細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)水平Figure2Levelsofsurfacemarkersofparathyroidcells圖注：圖A為hTERT基因表達(dá)電泳圖；B為hTERT基因相對(duì)表達(dá)量。與正常對(duì)照組及空載病毒組比較，aP<0.05。圖3hTERT基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中hTERT基因表達(dá)Figure3ExpressionofhTERTgeneinthehTERT-transfectedcells表2hTERT基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中hTERT基因和蛋白表達(dá)(x_±s，hTERT/β-actin)Tabl

鼠頸部分離切取甲狀旁腺之后，病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷確認(rèn)其為甲狀旁腺；而后的細(xì)胞鑒定進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。鈣敏感性受體、甲狀旁腺激素及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失轉(zhuǎn)錄因子(GCM2)這3個(gè)分子是甲狀旁腺細(xì)胞特征性的標(biāo)志物，Westernblot陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果表明提取的細(xì)胞確系甲狀旁腺細(xì)胞[18-22]。實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染hTERT后，基因轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞中的hTERT的基因和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，由此可知此圖注：圖A為hTERT蛋白表達(dá)電泳圖；B為hTERT蛋白相對(duì)表達(dá)量。與正常對(duì)照組及空載病毒組比較，aP<0.05。圖4hTERT基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中hTERT蛋白表達(dá)水平Figure4LevelofhTERTproteininthehTERT-transfectedcells表3甲狀旁腺細(xì)胞的增殖活性(x_±s，n=3，A值)Table3Proliferationactivityofparathyroidcells時(shí)間正常對(duì)照組空載病毒組hTERT基因轉(zhuǎn)染組24h0.11±0.020.12±0.050.19±0.0348h0.16±0.050.18±0.030.36±0.0472h0.20±0.040.22±0.020.50±0.04a96h0.25±0.060.28±0.030.69±0.05a120h0.29±0.050.32±0.020.80±0.06a表注：與正常對(duì)照組及空載病毒組比較，aP<0.05。24h48h72h96h120h1.000.750.500.250aaa正常對(duì)照組空載病毒組hTERT基因轉(zhuǎn)染組A490nm圖注：與正常對(duì)照組及空載病毒組比較，aP<0.05。圖5各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Figure5Growthcurvesofthecells表4各組細(xì)胞周期分布情況(x_±s，n=3，%)Table4Cellcycledistribution周期分布正常對(duì)照組空載病毒組hTERT基因轉(zhuǎn)染組G0/G1期42.13±1.4045.32±1.4925.13±1.55aG2/M期9.81±1.639


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