目的:初步探討精子相關(guān)抗原6（SPAG6）在小鼠精子發(fā)生過(guò)程中頂體形成階段的表達(dá)及其調(diào)控作用。方法:采用Western印跡檢測(cè)出生后小鼠睪丸發(fā)育不同階段（第8、12、16、20、24、28、30、35天）中SPAG6的表達(dá);免疫熒光觀察SPAG6在生精細(xì)胞中的定位;分別構(gòu)建SPAG6和SPINK2蛋白表達(dá)質(zhì)粒,以AH109和CHO細(xì)胞為對(duì)象,采用酵母雙雜交及細(xì)胞內(nèi)共定位實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SPAG6與SPINK2蛋白間相互作用;免疫熒光檢測(cè)SPINK2在SPAG6基因敲除（KO）小鼠的睪丸生精細(xì)胞中的表達(dá)與定位。結(jié)果:小鼠出生后第16～28天,SPAG6表達(dá)顯著升高,且定位于圓形精子細(xì)胞的頂體;酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示SPAG6/SPINK2組能在選擇性培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Trp/-His）中生長(zhǎng);CHO細(xì)胞共轉(zhuǎn)染SPAG6和SPINK2表達(dá)質(zhì)粒時(shí),SPAG6與SPINK2共定位在細(xì)胞核周圍;SPAG6 KO小鼠睪丸生精細(xì)胞中未檢測(cè)到SPINK2表達(dá)及定位于精子頂體。結(jié)論:SPAG6與SPINK2形成蛋白復(fù)合體,并可能通過(guò)調(diào)控SPINK2的穩(wěn)定表達(dá)參與精子頂體形成。 

【文章來(lái)源】：中華男科學(xué)雜志. 2019,25(03)北大核心CSCD

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SPAG6在小鼠第一波精子發(fā)生過(guò)程的表達(dá)Figure1．ExpressionofSPAG6duringthefirstwaveofspermatogenesisofthemiceondifferentpostnataldays(PN)

圖1SPAG6在小鼠第一波精子發(fā)生過(guò)程的表達(dá)Figure1．ExpressionofSPAG6duringthefirstwaveofspermatogenesisofthemiceondifferentpostnataldays(PN)圖2SPAG6定位于圓形精子細(xì)胞的頂體凝集素:精子頂體熒光標(biāo)記(綠色);DAPI染色標(biāo)記DNA(藍(lán)色)Figure2．LocalizationofSPAG6intheacrosomeoftheroundspermatidsGreenindicatesLectinandblueindicatesDAPI．2．3SPAG6與SPINK2蛋白發(fā)生相互作用構(gòu)建pGBKT7/SPAG6和pGADT7/SPINK2重組質(zhì)粒并采用直接酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPAG6與SPINK2相互作用。如圖3結(jié)果所示，AH109菌株共轉(zhuǎn)染了含pGADT7和pGBKT7載體能夠在SD培養(yǎng)基同時(shí)缺少亮氨酸(-Leu)和色氨酸(-Trp)的平板上生長(zhǎng)，但是不能在SD培養(yǎng)基同時(shí)缺少亮氨酸(-Leu)、色氨酸(-Trp)和組氨酸(-His)的平板上生長(zhǎng)。同陽(yáng)性對(duì)照組pGADT7/IgT+pGBKT7/p53一樣，pGADT7/SPINK2+pGBKT7/SPAG6配對(duì)實(shí)驗(yàn)組能在非選擇性(SD/-Leu/-Trp)和選擇性培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His)中均有生長(zhǎng)(圖3A)。此外，構(gòu)建蛋白表達(dá)質(zhì)粒pTarget/SPAG6和pEGFP-N2/SPINK2共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞，免疫熒光染色顯示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染pTarget/SPAG6或pEGFP-N2/SPINK2時(shí)，SPAG6和SPINK2分散在細(xì)胞質(zhì)(圖3Bb，3Bd)，當(dāng)SPAG6與SPINK2共轉(zhuǎn)染時(shí)，SPAG6與SPINK2共定位在細(xì)胞核周圍(圖3Bh)，表明SPAG6和SPINK2發(fā)生相互作用。2．4SPAG6缺失對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞中SPINK2蛋白表達(dá)的影響免疫熒光檢測(cè)顯示，SPINK2定位于野生型小鼠生精細(xì)胞頂體，而SPAG6KO小鼠生精細(xì)胞中未檢測(cè)到SPINK2和凝集素表達(dá)(圖4)，可能導(dǎo)

圖4SPAG6缺失對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞中SPINK2蛋白表達(dá)的影響凝集素:精子頂體熒光標(biāo)記(綠色);DAPI染色標(biāo)記DNA(藍(lán)色)Figure4．ExpressionoftheSPINK2proteininthetesticulargermcellsoftheSPAG6-knockout(KO)mouseGreenindicatesLectinandblueindicatesDAPI．3討論哺乳動(dòng)物SPAG6最初被證明是維持精子鞭毛中心軸絲結(jié)構(gòu)完整和調(diào)節(jié)精子鞭毛運(yùn)動(dòng)的重要蛋白［2］。研究SPAG6在第一波精子發(fā)生中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在小鼠出生后第16～28天(即圓形精子期和伸長(zhǎng)期［17-18］)，該蛋白表達(dá)量顯著升高。而且，SPAG6定位于圓形精子的頂體。這些結(jié)果提示，SPAG6不僅調(diào)節(jié)精子鞭毛的擺動(dòng)，而且可能調(diào)控精子發(fā)生過(guò)程。為了進(jìn)一步研究SPAG6在精子發(fā)生中的作用，本課題組采用酵母雙雜交篩選小鼠cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)SPINK2可能與SPAG6相互結(jié)合。通過(guò)直接酵母雙雜交和細(xì)胞內(nèi)共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩種蛋白能發(fā)生相互作用。SPINK2蛋白僅在小鼠睪丸及附睪組織中表達(dá)，并定位于圓形精子細(xì)胞的頂體囊泡和成熟精子的頂體［15，19］。研究SPINK2基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，該蛋白缺失促使頂體酶原異常活化，過(guò)早釋放頂體素，引起圓形精子細(xì)胞內(nèi)高爾基體碎裂，前頂體顆粒(proacrosomalgranule)不能融合成頂體囊泡(acroso-malvesicle)，導(dǎo)致頂體形成受阻，生精細(xì)胞分化停滯在圓形精子細(xì)胞階段，進(jìn)而引起雄性不育［14］。結(jié)果表明SPINK2蛋白參與精子頂體形成，在精子變形期起著重要作用。泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)一種蛋白質(zhì)降解調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在精子變形階段的核小體重塑、頂體生物合成及精子尾部形成等過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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