目的：構(gòu)建弓形蟲致密顆�？乖�-1（GRA1）真核表達質(zhì)粒，并觀察重組質(zhì)粒DNA接種誘導(dǎo)的保護性免疫應(yīng)答。 方法：1、用免疫兔血清和2個單克隆抗體篩選弓形蟲速殖子cDNA文庫，對陽性克隆進行序列分析；2、采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增出編碼GRA1目的基因，用EcoRⅠ／XhoⅠ分別對擴增產(chǎn)物和真核表達質(zhì)粒pcDNA3進行雙酶切，將GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位點；對重組質(zhì)粒進行PCR擴增、雙酶切初步鑒定后作序列測定；3、大量制備并提取重組質(zhì)粒pcDNA3／GRA1，肌肉注射法免疫小鼠；用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性抗體水平及PCR檢測不同組織DNA中GRA1基因；用免疫熒光法（IFA）檢測GRA1蛋白在肌肉組織中的表達；用弓形蟲RH株速殖子攻擊感染免疫鼠，并觀察其存活時間。 結(jié)果：1、通過篩選弓形蟲cDNA文庫，共獲得12個陽性克隆。經(jīng)序列測定發(fā)現(xiàn)插入片段的大小在450bp-2400bp之間，查詢所有基因庫并經(jīng)EPAS（Expert Protein Analysis System）軟件分析鑒定出 3個新的基因，分別命名為Toxo-W5，T... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

弓形蟲速殖子cDNA文庫免疫篩選結(jié)果.陽性克隆的第三次篩選

論文弓形蟲真核表達質(zhì)粒PcDNA3/GRAI的構(gòu)建及序列測定條與GRAI基因ORF片段大小一致的條帶，約為573bp;將重組子用反解I和肋口I雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，即5.4Kb、0.57Kb(圖2一2);測序結(jié)果表明，該重組子含有GRAIORF基因片段(圖2一3)。圖2一1.PCR擴增的GRAIO盯圖2一2.重組子雙酶切結(jié)果Fig.2一1AgarosegeleleetroPhoresisOfGRAIeneodinggeneobtainedbyPCRl:GRA12:Marker(kb)Fig.2一2RecombinantPcDNA3/GRA1digestedbyEeoRI/Xholl:PeDNA3/GRA12:Marker(kb)TAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCCATGGTGCGTGTGAGCGCTATTGTCGGAGCTGCTGCATCGGTGTTCGTGTGCCTGTCTGCCGGCGCTTACGCTGCCGAAGGCGGCGACAACCAGTCGAGCGCCGTCTCAAATCGGGCGTCTCTCTTTGGTTTGCTGAGTGGAGGGACAGGGCAGGGATTAGG^^丁eeGAG^^丁e丁G丁^彝A丁蘸丁G。^e^下GA丁。eGoAAeAee丁A丁e。下G丁GG^GAG^eeeAeAGGCAACCCGGACTTGCTCAAGATCGCCATTAAAGCTTCAGATGGATCGTACAGCGAAGTCGGCAATGTTAACGTGGAGGAGGTGATTGATACTATGAAAAGCATGCAGAGGGACGAGGACATTTTCCTTCGTGCGTTGAACAAAGGCGAAACAGTAGAGGAAGCGATCGAAGACGTGGCTCAAGCAGAAGGGTTTAATTCGGAGCAAACCCTGCAACTGGAAAATGCAGTGAGCGCGGTGGCGTCTGTTGTTCAAGACGAGATGAAGGTGATCGACGATGTGCAGCAGCTTGAAAAGGACAAACAACAGCTTAAGGATGACATTGGGTTCCTAACAGGAGAGAGAGAGTAATTGGAGGTAGCTTTGTTGTGATCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCC圖2一3.重組子GRAIORF序歹，!Fig.2一3SequeneeofreeombinantGRAIO盯(下劃線部分為引物位置Underlinedpartindieatingprimers

弓形蟲PcDNA3/GRAI重組質(zhì)粒免疫小鼠的保護性效果觀察圖3一1不同免疫組小鼠的組織DNAPCR產(chǎn)物凝膠電泳分析M:Marker(bp)1:pcDNA3/GRAI雙酶切結(jié)果2:pcDNA3/GR^1免疫小鼠的肌肉3:poDNA3免疫小鼠的肌肉4:生理鹽水對照組小鼠的肌肉5:peDNA3/GRAI免疫小鼠的血細胞6:pcDNA3免疫小鼠的血細胞7:生理鹽水對照組小鼠的血細胞Fig.3一1Agarosegel一eleetroPhoresisoftissueDNAPCRProduetsofvariousimmunitedgrouPsM:Markerl:PeDNA3/GRAIdigestedbyEeoRI/Xho1.2:MuseleofmieeimmunizedwithPeDNA3/GRAI.3:MuseleofmieeimmunizedwithPeDNA3.4:MuseleofmieeimmunizedwithNS.5:BloodeellsofmieeimmunizedwithPcDNA3/GRAI.6:BloodeellsofmieeimmunizedwithPcDNA3.7:BloodeellsofmieeimmunizedwithNS.歡，撬，!一襄鸚一，纓圖3一2pcDNA3/GRAI免疫小鼠的不同組織DNAPCR產(chǎn)物檢測1:肝臟2:心臟3:脾臟4:肺臟5:血液6:腎臟7:肌肉Fig.3一2PCRProduetsfromdifferenttissuesofmiceimmunizedWithPeDNA3/GRAI.l:liverZ:heart3:sPleen4:lungs:blood6:kidney7:musele3.2.3免疫熒光法檢測GRAI基因在小鼠肌細胞的表達用弓形蟲免疫兔血清同時檢測三組小鼠肌肉組織切片中GRAI表達情況，在pcDNA3/GRAI免疫組肌細胞上可見呈點狀或片狀分布的熒光反應(yīng)(圖3一3)，而pcDNA3和NS免疫組無陽性反應(yīng)(圖3一4)。表明GRAI在pcDNA3/GRAI免疫組小鼠的肌細胞內(nèi)獲得表達。3.2.4抗攻擊感染的免疫保護作用于免疫后的第5周經(jīng)腹腔注射約500

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3059170