本文關鍵詞：超正電荷ZFN融合蛋白在大腸桿菌中的表達、純化及其功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是一種感染人類免疫系統(tǒng)的病毒,可通過破環(huán)人的淋巴細胞影響細胞免疫和體液免疫過程,導致免疫系統(tǒng)癱瘓,對人類健康存在極大威脅。最新的研究結果表明,CCR5受體是HIV進入T細胞的共受體,因此破壞基因組中的CCR5基因或阻止CCR5基因表達成了阻斷HIV侵染人類T細胞的一種新途徑。本文運用Ni磁珠與Co磁珠親和層析技術純化出超正電荷ZFN融合蛋白,驗證出該蛋白具有切割CCR5基因的活性,從而為后續(xù)阻斷HIV進入T細胞以及HIV基因治療提供了新思路。本文主要研究結果如下:1.超正電荷ZFN融合蛋白的表達運用IPTG對轉化了p ET22b-(+)36GFP/ZFNL和p ET22b-(+)36YFP/ZFNR質粒的兩種菌株進行誘導,然后分別在不同溫度和不同IPTG濃度的條件下過夜培養(yǎng),次日分別收集菌體進行超聲破碎,SDS-PAGE檢測蛋白分布情況。實驗結果確定16℃,0.5m M IPTG誘導是融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR表達的最適條件。2.超正電荷ZFN融合蛋白純化條件的摸索1)通過Ni磁珠親和層析技術純化+36GFP/ZFNL融合蛋白,發(fā)現(xiàn)高鹽裂解液條件有利于此融合蛋白掛柱,后續(xù)洗脫可以有效獲得該融合蛋白。2)+36YFP/ZFNR融合蛋白同樣在高鹽裂解液條件下有利于其掛柱,但后續(xù)洗脫困難,推測該融合蛋白與Ni磁珠結合過于牢固。然后運用了Co磁珠和已使用兩次的Ni磁珠對該融合蛋白進行純化,發(fā)現(xiàn)該方法可以有效獲得+36YFP/ZFNR融合蛋白。3.重組質粒Pet22b/CCR5的構建以HCC1954細胞中的基因組DNA作為PCR擴增模板,有效獲得人CCR5基因。隨后將CCR5目的基因連接到質粒載體Pet22b,經菌落PCR,雙酶切及基因測序等方法驗證了CCR5基因無突變。4.超正電荷ZFN融合蛋白活性檢測將重組質粒p ET22b/CCR5與上述純化的兩個超正電荷ZFN融合蛋白在37℃共孵育1h后,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)隨著超正電荷ZFN融合蛋白摩爾量的增加,重組質粒p ET22b/CCR5被切割成線性質粒產物的量也在增加,表明ZFN蛋白活性功能在增強。同時,發(fā)現(xiàn)當超正電荷ZFN融合蛋白摩爾量增加到7n M后,該蛋白會對重組質粒p ET22b/CCR5產生非特異性切割。綜上所述,我們在大腸桿菌中成功表達了超正電荷ZFN融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR,并利用Ni親和層析技術對上述兩種融合蛋白進行了純化。在此基礎上,本文還構建了重組質粒Pet22b/CCR5,驗證了這一對超正電荷ZFN融合蛋白對靶基因的體外切割活性即ZFN融合蛋白對基因組DNA的編輯功能。本文為研究超正電荷ZFN融合蛋白在體內的活性奠定了堅實的理論基礎,也為HIV基因治療方法提供了新思路。
【關鍵詞】：超正電荷ZFN融合蛋白 CCR5基因 HIV 親和層析技術
【學位授予單位】：山東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R373
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 第1章 綜述10-19
• 1.1 HIV的流行概況10
• 1.2 CCR510-12
• 1.3 以CCR5為目標的HIV基因治療方法概況12-14
• 1.3.1 小分子阻礙物13
• 1.3.2 針對CCR5的單克隆抗體13
• 1.3.3 具有編輯作用的趨化因子13-14
• 1.3.4 鋅指核酸酶（ZFN）14
• 1.4 靶標CCR5基因治療HIV的臨床研究進展14-17
• 1.5 以+36GFP和+36YFP為載體的ZFN蛋白輸送系統(tǒng)17
• 1.6 選題依據和研究意義17-18
• 1.7 研究內容及研究展望18-19
• 第2章 +36GFP-ZFNL融合蛋白的表達、純化及定量分析19-37
• 2.1 實驗材料19-21
• 2.1.1 質粒、菌株及試劑盒19
• 2.1.2 實驗試劑19-20
• 2.1.3 實驗設備20-21
• 2.2 實驗方法21-30
• 2.2.1 主要溶液、緩沖液及培養(yǎng)基的配置21-23
• 2.2.2 質粒單雙酶切23-24
• 2.2.3 融合蛋白小量誘導表達24-26
• 2.2.4 小量體積條件下純化融合蛋白26-27
• 2.2.5 大量體積條件下純化融合蛋白27-29
• 2.2.6 蛋白濃度測定29-30
• 2.3 實驗結果30-36
• 2.3.1 pET22b/+36GFP-ZFNL質粒酶切驗證30
• 2.3.2 BL21中+36GFP-ZFNL表達條件的優(yōu)化30-32
• 2.3.3 BL21中+36GFP-ZFNL純化方法的摸索32-34
• 2.3.4 +36GFP-ZFNL融合蛋白透析及濃縮34-35
• 2.3.5 +36GFP-ZFNL融合蛋白的濃度測定及其定量分析35-36
• 2.4 討論36-37
• 第3章 +36YFP-ZFNR融合蛋白的表達、純化及定量分析37-44
• 3.1 實驗材料37
• 3.1.1 質粒、菌株及試劑盒37
• 3.1.2 實驗試劑37
• 3.1.3 實驗設備37
• 3.2 實驗方法37
• 3.3 實驗結果37-43
• 3.3.1 pET22b/+36YFP-ZFNR質粒酶切驗證37-38
• 3.3.2 BL21中+36YFP-ZFNR融合蛋白表達條件的優(yōu)化38-39
• 3.3.3 BL21中+36YFP-ZFNR融合蛋白的純化39-42
• 3.3.4 +36YFP-ZFNR融合蛋白的濃度測定及定量分析42-43
• 3.4 討論43-44
• 第4章 構建重組質粒pET22b/CCR544-62
• 4.1 實驗材料44-45
• 4.1.1 質粒、菌株及試劑盒44
• 4.1.2 實驗試劑44-45
• 4.1.3 實驗設備45
• 4.2 實驗方法45-55
• 4.2.1 培養(yǎng)HCC1954細胞并提取其基因組DNA45-46
• 4.2.2 CCR5目的基因片段的制備46-52
• 4.2.3 pET22b載體的制備52
• 4.2.4 pET22b/CCR5重組質粒的連接構建52-53
• 4.2.5 pET22b/CCR5鑒定-菌落PCR53-54
• 4.2.6 pET22b/CCR5鑒定-雙酶切54-55
• 4.2.7 pET22b/CCR5鑒定-測序55
• 4.3 實驗結果55-60
• 4.3.1 培養(yǎng)HCC1954細胞并提取其基因組DNA55-56
• 4.3.2 PCR擴增目的片段及純化回收56-57
• 4.3.3 載體pET22b、PCR產物的雙酶切后的純化回收57-58
• 4.3.4 陽性重組質粒pET22b/CCR5的構建、篩選及鑒定58-60
• 4.4 討論60-62
• 第5章 +36GFP-ZFNL和+36YFP-ZFNR融合蛋白體外活性檢測62-67
• 5.1 實驗材料62-63
• 5.1.1 蛋白、質粒及試劑62
• 5.1.2 實驗設備62-63
• 5.2 實驗方法63-64
• 5.2.1 配置reaction buffer緩沖液63
• 5.2.2 梯度稀釋超正電荷ZFN融合蛋白至所需濃度63-64
• 5.2.3 超正電荷ZFN融合蛋白體外活性檢測64
• 5.3 實驗結果64-65
• 5.3.1 超正電荷ZFN融合蛋白作用于重組質粒pET22b/CCR564-65
• 5.3.2 反復凍融對超正電荷ZFN融合蛋白活性的影響65
• 5.4 討論65-67
• 結論67-68
• 參考文獻68-71
• 致謝71

【相似文獻】

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1 王璋瑜;;蛋白設計實驗室公司買下融合蛋白技術實用權[J];生物技術通報;1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應用及研究[J];生物工程進展;2000年03期

3 楊林,李國清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼

本文編號：298244