丙肝病毒全基因組cDNA克隆侵染細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立
發(fā)布時(shí)間：2021-01-10 23:22
以含有丙肝病毒（Hepatitis C Virus,HCV）全基因組cDNA的重組質(zhì)粒（pHCV）為材料,通過基因轉(zhuǎn)染,重組痘病毒輔助使之在HeLa細(xì)胞中產(chǎn)生HCV病毒體,建立了一種新的HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。采用RT-PCR、熒光定量RT-PCR、鏈特異性RT-PCR、免疫印跡、免疫電子顯微鏡和電子顯微鏡負(fù)染技術(shù)跟蹤檢測(cè)HCV的復(fù)制、蛋白表達(dá)、裝配、釋放和二次感染情況,評(píng)估該細(xì)胞培養(yǎng)體系HCV的產(chǎn)生效率,檢測(cè)結(jié)果如下: 1、RT-PCR、鏈特異性RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞內(nèi)有HCV正、負(fù)鏈的合成。而熒光定量RT-PCR的測(cè)定結(jié)果表明,pHCV可在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中高效復(fù)制HCV基因組,產(chǎn)生的HCV基因組達(dá)到107基因拷貝/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于病人血清中的HCV基因拷貝數(shù),也高于迄今報(bào)道的HCV細(xì)胞培養(yǎng)體系的復(fù)制效率。且HCV基因拷貝數(shù)的增加是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程,呈現(xiàn)先逐步升高,達(dá)到一個(gè)峰值后緩緩下降的趨勢(shì)。 2、Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,本培養(yǎng)體系中有HCV結(jié)構(gòu)蛋白（E2,Core）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS5）的表達(dá),其分子量...
【文章來源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：57 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
丙型肝炎病毒基因結(jié)構(gòu)及多聚蛋白加工圖(Bartensehlageretal，2001)
SA承擔(dān)了同樣的作用。NSSA磷酸化是通過目前仍不知道的細(xì)胞胞內(nèi)激酶介導(dǎo)的l，1997;Reedetal，1997:Tanjietal，1995b)。此外，Ns5A蛋白可能參與了]FN誘染細(xì)胞的抗性作用。至少從分離的HCV株看來，NSSA能夠結(jié)合PKR，使IFN處的病毒翻譯水平不致降低(Galeetal，1997，1998)。在NSSA相當(dāng)于所編碼產(chǎn)物第2209一2248位氨基酸殘叢的區(qū)域存在干擾素敏感區(qū)(sIDR)，被認(rèn)為是不卜JiHCV對(duì)干擾素治療反應(yīng)性有差異的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。NSSB經(jīng)認(rèn)定是HCV復(fù)制所賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)。NSSB基因區(qū)是高度遺傳保守的。不僅僅在的不同基因型間，而且與瘟病毒、黃病毒以及其他的RNA病毒比較，都是高度特別是具有作為RNA聚合酶特征序列的G一D一D位點(diǎn)在黃病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒葉病毒中都是一致的(AIetal，1998;Behrensetal，1996:Lohmannetal，1997:ashitaetal，1998;Yuanetal，1997)。、丙肝病毒的復(fù)制
了卓有成效的工作。他們探索了HCV基因組適應(yīng)性突變對(duì)病毒亞基因組RNA復(fù)制通過對(duì)26個(gè)不同適應(yīng)性突變位點(diǎn)的HVC亞基因組復(fù)制子的復(fù)制效率進(jìn)行比較，尋病毒NRA復(fù)制效率提高的保守性突變位點(diǎn)(如圖1.4所示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在非結(jié)構(gòu)蛋的每一個(gè)突變位點(diǎn)幾乎都會(huì)使HVC的復(fù)制效率有所提高。其中，位于NS3區(qū)的突病毒NRA復(fù)制效率提高影響不大，但當(dāng)其與高適應(yīng)性突變位點(diǎn)結(jié)合在一起時(shí)具有，可以使RNA的復(fù)制效率大大提高(Lohmnna.etal2003)。如位于NS3區(qū)的E1202G2801突變位點(diǎn)可以分別使HCV病毒RNA的復(fù)制效率提高14倍和7倍，而這兩個(gè)突變合在一起時(shí)可以使突變效率提高25倍。當(dāng)這兩個(gè)突變位點(diǎn)與NSSA區(qū)的52197P共同起作用時(shí)復(fù)制效率會(huì)有更大的提高(Blightetal，2003)。位于Ns4B、Ns5A、N變位點(diǎn)是細(xì)胞高適應(yīng)性突變位點(diǎn)，能使病毒RNA復(fù)制效率有較大的提高，但是這點(diǎn)間不具有協(xié)同效應(yīng)。
本文編號(hào)：2969606
【文章來源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：57 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
丙型肝炎病毒基因結(jié)構(gòu)及多聚蛋白加工圖(Bartensehlageretal，2001)
SA承擔(dān)了同樣的作用。NSSA磷酸化是通過目前仍不知道的細(xì)胞胞內(nèi)激酶介導(dǎo)的l，1997;Reedetal，1997:Tanjietal，1995b)。此外，Ns5A蛋白可能參與了]FN誘染細(xì)胞的抗性作用。至少從分離的HCV株看來，NSSA能夠結(jié)合PKR，使IFN處的病毒翻譯水平不致降低(Galeetal，1997，1998)。在NSSA相當(dāng)于所編碼產(chǎn)物第2209一2248位氨基酸殘叢的區(qū)域存在干擾素敏感區(qū)(sIDR)，被認(rèn)為是不卜JiHCV對(duì)干擾素治療反應(yīng)性有差異的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。NSSB經(jīng)認(rèn)定是HCV復(fù)制所賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)。NSSB基因區(qū)是高度遺傳保守的。不僅僅在的不同基因型間，而且與瘟病毒、黃病毒以及其他的RNA病毒比較，都是高度特別是具有作為RNA聚合酶特征序列的G一D一D位點(diǎn)在黃病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒葉病毒中都是一致的(AIetal，1998;Behrensetal，1996:Lohmannetal，1997:ashitaetal，1998;Yuanetal，1997)。、丙肝病毒的復(fù)制
了卓有成效的工作。他們探索了HCV基因組適應(yīng)性突變對(duì)病毒亞基因組RNA復(fù)制通過對(duì)26個(gè)不同適應(yīng)性突變位點(diǎn)的HVC亞基因組復(fù)制子的復(fù)制效率進(jìn)行比較，尋病毒NRA復(fù)制效率提高的保守性突變位點(diǎn)(如圖1.4所示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在非結(jié)構(gòu)蛋的每一個(gè)突變位點(diǎn)幾乎都會(huì)使HVC的復(fù)制效率有所提高。其中，位于NS3區(qū)的突病毒NRA復(fù)制效率提高影響不大，但當(dāng)其與高適應(yīng)性突變位點(diǎn)結(jié)合在一起時(shí)具有，可以使RNA的復(fù)制效率大大提高(Lohmnna.etal2003)。如位于NS3區(qū)的E1202G2801突變位點(diǎn)可以分別使HCV病毒RNA的復(fù)制效率提高14倍和7倍，而這兩個(gè)突變合在一起時(shí)可以使突變效率提高25倍。當(dāng)這兩個(gè)突變位點(diǎn)與NSSA區(qū)的52197P共同起作用時(shí)復(fù)制效率會(huì)有更大的提高(Blightetal，2003)。位于Ns4B、Ns5A、N變位點(diǎn)是細(xì)胞高適應(yīng)性突變位點(diǎn)，能使病毒RNA復(fù)制效率有較大的提高，但是這點(diǎn)間不具有協(xié)同效應(yīng)。
本文編號(hào)：2969606
本文鏈接：http://www.sikaile.net/yixuelunwen/binglixuelunwen/2969606.html
最近更新
教材專著
