目的：探討新型納米微囊載體應用于基因治療的可行性，安全性、轉染效率、轉移方法并與陽離子脂質體、質粒DNA進行比較。方法：以血管內皮細胞生長因子(VEGF₁₆₅)為目的基因，構建真核表達載體pcDNA3.1／myc-hisA^-VEGF₁₆₅，分別利用納米微囊、陽離子脂質體介導VEGF₁₆₅轉染鼠成纖維細胞（NIH3T3），轉染4小時后鏡下觀察細胞轉染后表型變化，48h后通過綠色熒光蛋白的表達觀察瞬時轉染效率，通過免疫組織化學、Western Blot檢測基因表達水平及定位。MTT法檢測對轉基因細胞的毒性。ELISA檢測經G418篩選后上清培養(yǎng)液VEGF蛋白持續(xù)表達情況。結果：經G418篩選后的陽性細胞克隆，為高表達VEGF的鼠成纖維細胞模型。免疫組織化學證實pcDNA3.1／myc-hisA^-VEGF₁₆₅在轉基因的細胞中呈高表達，定位于胞漿。Western Blot結果顯示納米微囊轉染NIH3T3后細胞胞漿及培養(yǎng)上清中均有VEGF蛋白表達。免疫熒光顯示納米... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

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英文摘要
前言和文獻回顧
正文
    1 材料與方法
        1.1 材料
    2 方法
        2.1 大腸桿菌（TOP10）感受態(tài)的制備
- VEGF質粒轉化大腸桿菌（TOP10）感受態(tài)">        2.2 pcDNA3.1／myc-hisA^- VEGF質粒轉化大腸桿菌（TOP10）感受態(tài)
- VEGF質粒的少量制備">        2.3 pcDNA3.1／myc-hisA^- VEGF質粒的少量制備
        2.4 限制性內切酶酶切反應
        2.5 人源性VEGF基因片段的檢測
        2.6 pIRES2-EGFP／VEGF質粒構建
        2.7 細胞培養(yǎng)及G418濃度的確定
        2.8 脂質體（Lipofectamine 2000）介導基因轉染
        2.9 納米微囊介導基因轉染
165在細胞內表達的免疫組化檢測">        2.10 VEGF₁₆₅在細胞內表達的免疫組化檢測
        2.11 納米微囊、脂質體介導的VEGF165蛋白表達水平的Western Blot分析
165蛋白表達的ELISA檢測">        2.12 VEGF₁₆₅蛋白表達的ELISA檢測
-VEGF敏感性">        2.13 MTT法檢測NIH3T3細胞體外對脂質體和10mM的納米微囊介導pcDNA3.1／myc-hisA^-VEGF敏感性
    3 結果
小結
參考文獻
附錄
個人簡歷和研究成果
致謝



本文編號：2919729