本文關(guān)鍵詞：鼻疽諾卡菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵襲蛋白生物信息分析及克隆表達(dá)與侵襲性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的了解mce基因及蛋白質(zhì)序列的特征,并對(duì)其同源性進(jìn)行分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù),對(duì)鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個(gè)mce蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè);從鼻疽諾卡菌IFM10152基因組中擴(kuò)增6個(gè)mce基因(mce1A-mce1F),構(gòu)建6個(gè)mce基因的表達(dá)載體;誘導(dǎo)表達(dá)鼻疽諾卡菌mce1操縱子中的6個(gè)mce蛋白,并將誘導(dǎo)成功的蛋白進(jìn)行純化;將純化后的蛋白進(jìn)行復(fù)性,并進(jìn)行侵襲功能的鑒定。方法從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取mce基因及氨基酸序列,利用生物信息軟件Lasergene和MEGA對(duì)其進(jìn)行分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù);綜合BepiPred法、可塑性方案、抗原性方案、表面可及性方案、親水性方案以及二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)6個(gè)mce蛋白進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè);采用PCR技術(shù)擴(kuò)增6個(gè)mce基因,利用基因重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體;利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),超聲裂解后利用SDS-PAGE鑒定其表達(dá)形式,將獲得的蛋白利用His Bind蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化,并通過(guò)透析法對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行復(fù)性;利用乳膠微粒包被復(fù)性后的蛋白,與HeLa細(xì)胞共同培養(yǎng),收集細(xì)胞后,利用透射電子顯微鏡觀察侵襲結(jié)果。結(jié)果(1)鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個(gè)mce基因之間的相似性為40.1%~54.6%,不同菌之間mce蛋白具有一定的同源性;(2)鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個(gè)mce蛋白均含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),二級(jí)結(jié)構(gòu)以不規(guī)則卷曲為主,mce1A、mce1D、mce1E蛋白均含有6個(gè)B細(xì)胞抗原表位mce1B蛋白含有7個(gè)B細(xì)胞抗原表位,mce1C蛋白含有2個(gè)B細(xì)胞抗原表位,mce1F蛋白含有10個(gè)B細(xì)胞抗原表位,且大多位于蛋白質(zhì)C-端;(3)成功擴(kuò)增了6個(gè)mce基因,并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30a-mce1A、pET30a-mce1B、pET30a-mce1C、pET30a-mce1D、pET30a-mce1E、pET30a-mce1F,成功誘導(dǎo)表達(dá)了mce1A、mce1C、mce1D、mce1E蛋白,其中mce1A、mce1C蛋白的表達(dá)量較低,mce1D、mce1E則獲得了大量的表達(dá),各蛋白均以包涵體的形式存在;(4)成功純化了mce1A、mce1D、mce1E蛋白,并對(duì)mce1D、mce1E蛋白進(jìn)行了復(fù)性;(5)經(jīng)乳膠微粒包被后的mce1D、mce1E蛋白侵襲HeLa細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均能進(jìn)入到HeLa細(xì)胞內(nèi)。結(jié)論鼻疽諾卡菌mce1操縱子不同mce蛋白之間及不同菌的mce蛋白之間具有一定的同源性;鼻疽諾卡菌mce蛋白為膜蛋白,大部分結(jié)構(gòu)位于膜外,且具有多個(gè)潛在的B細(xì)胞抗原表位;鼻疽諾卡菌mce蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)受基因本身及載體的影響,同時(shí)也與IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間有關(guān);獲得了純化后的蛋白,進(jìn)行復(fù)性后驗(yàn)證了mce1D、mce1E蛋白具有侵襲功能。
【關(guān)鍵詞】：鼻疽諾卡菌 生物信息學(xué) 抗原表位 克隆表達(dá) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵襲蛋白
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378;Q811.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 前言12-16
• 第二章 鼻疽諾卡菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵襲蛋白的生物信息分析16-30
• 1 材料與方法16-17
• 1.1 序列16
• 1.2 在線分析的主要網(wǎng)站16
• 1.3 生物信息分析軟件16
• 1.4 鼻疽諾卡菌mce基因序列與氨基酸序列的獲取及及其分析16
• 1.5 鼻疽諾卡菌mce(1A-1F)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)16
• 1.6 鼻疽諾卡菌mce(1A-1F)蛋白抗原表位預(yù)測(cè)16-17
• 2 結(jié)果17-27
• 2.1 鼻疽諾卡菌mce1操縱子各mce基因序列的同源性分析結(jié)果17-18
• 2.2 Mce蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析18-19
• 2.3 鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個(gè)mce蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果19-21
• 2.4 鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個(gè)mce蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)21-22
• 2.5 鼻疽諾卡菌mce1操縱子各蛋白的抗原表位預(yù)測(cè)22-27
• 3 討論27-30
• 第三章 鼻疽諾卡菌mce1操縱子哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵襲蛋白的克隆表達(dá)及純化30-54
• 1 實(shí)驗(yàn)材料和方法30-43
• 1.1 材料和試劑30-33
• 1.2 主要溶液及培養(yǎng)基的配制33-36
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法36-43
• 2 結(jié)果43-50
• 2.1 mce基因PCR擴(kuò)增43
• 2.2 重組質(zhì)粒的鑒定43-44
• 2.3 mce重組蛋白誘導(dǎo)結(jié)果44-47
• 2.4 鼻疽諾卡菌mce1操縱子mce重組蛋白表達(dá)形式的鑒定及純化結(jié)果47-49
• 2.5 重組蛋白mce1D、mce1E的復(fù)性49
• 2.6 重組蛋白濃度的測(cè)定49-50
• 3 討論50-54
• 第四章 鼻疽諾卡菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵襲蛋白mce1D及mce1E侵襲功能的研究54-60
• 1 材料與方法54-57
• 1.1 材料與試劑54
• 1.2 主要溶液的配制54-55
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法55-57
• 2 結(jié)果57-58
• 3 討論58-60
• 第五章 結(jié)論與展望60-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 綜述 哺乳動(dòng)物侵襲蛋白研究進(jìn)展65-73
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 附錄73-79
• 作者攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文79-80
• 中英文縮略對(duì)照表80-81
• 致謝81

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1 李軍,席麗艷,魯長(zhǎng)明;鼻疽諾卡菌基因組DNA及細(xì)胞脂肪酸組成分析[J];中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志;2004年05期

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1 譚曉羅;鼻疽諾卡菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵襲蛋白生物信息分析及克隆表達(dá)與侵襲性研究[D];南華大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：鼻疽諾卡菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵襲蛋白生物信息分析及克隆表達(dá)與侵襲性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：288284