目的:建立大鼠高血壓致慢性心力衰竭模型,按照分組進行心肌細胞快速分離,在共聚焦顯微鏡下觀測鈣信號及單位釋放事件鈣火花,并通過研究與興奮收縮偶聯(lián)相關(guān)蛋白Junctophilin-2(JP-2)及鈣回攝相關(guān)蛋白SERCA2a蛋白量的變化與鈣火花變化的相關(guān)性。探討高血壓致慢性心力衰竭的演變過程及在其在病理狀態(tài)下鈣信號變化及其鈣循環(huán)過程的相關(guān)機制變化。方法:1.將實驗用大鼠按照隨機原則分成兩組,心衰模型組(n=40)與假手術(shù)對照組(n=26)。2.將心衰模型組大鼠采用腹主動脈縮窄法(TAC)建立壓力超負荷高血壓致心衰模型。假手術(shù)對照組只開腹穿線,不結(jié)扎,其他同法操作。3.對術(shù)后成活的大鼠定期進行尾動脈血壓監(jiān)測及酶聯(lián)免疫ELISA法檢測心衰標(biāo)志物BNP的表達量,用于判斷確定高血壓致心衰模型是否成功。4.造模4周初步成功后將兩組大鼠分別于術(shù)后的4周、6周、8周、10周、12周急性獲取心臟,消化獲得單個心室肌細胞,并用于后續(xù)檢測。5.激光共聚焦顯微鏡與膜片鉗聯(lián)用,觀察并記錄心室肌細胞鈣活動及單位釋放事件鈣火花的發(fā)生。6.蛋白印記法檢測心肌細胞興奮收縮偶聯(lián)結(jié)構(gòu)蛋白JP2及鈣回攝蛋白SERCA2a隨著心衰的發(fā)展的表達情況,評估高血壓心衰發(fā)展過程中的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:1.大鼠術(shù)后體征及高血壓造模成功率手術(shù)成功的大鼠在3~6h內(nèi)能夠恢復(fù)清醒,12h左右可以進食,精神狀態(tài)良好。心衰模型組的成活率為70.0%,在成活的模型大鼠中復(fù)制高血壓成功率為89.2%;假手術(shù)組大鼠成活率為96.1%。2.大鼠術(shù)后尾動脈壓監(jiān)測結(jié)果大鼠正常血壓在13~15kpa左右,在手術(shù)完成初期,衰模型組血壓與假手術(shù)組大鼠的血壓差異不明顯(P0.05);術(shù)后第21天,心衰模型組血壓明顯高于對照組,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);術(shù)后第28天,心衰模型組血壓持續(xù)上升(P0.05),并高于對照組血壓(P0.05);術(shù)后56天、63天模型組血壓出現(xiàn)下降(P0.05),此時血壓值仍然高于對照組(P0.05);術(shù)后84天,模型組大鼠血壓持續(xù)下降(P0.05),血壓值與高于對照組(P0.05)。對照組組間比較沒有差異(P0.05)。3.心衰標(biāo)志物B型腦鈉肽(BNP)檢測結(jié)果大鼠心衰模型組BNP水平在第4周時明顯升高,心衰模型組的血漿BNP水平明顯高于對照組(P0.05),同時期心衰模型組大鼠BNP水平高于對照組(P0.05);心衰組的BNP水平隨著心衰的進程逐漸升高(P0.05),組間差異明顯;4.大鼠急性分離心肌細胞結(jié)果狀態(tài)良好的單個心肌細胞呈桿狀,細胞成活率在80%左右。在顯微鏡下觀察,60%以上的細胞呈明顯的長桿狀,活性良好。5.心肌細胞鈣火花形態(tài)特征觀察結(jié)果與假手術(shù)組對比,最初兩組觀察到的鈣火花差異不是很明顯(P0.05);隨著心衰的發(fā)展,心衰模型組的心肌細胞觀察到的鈣火花在時空形態(tài)上都有明顯的差異,心衰模型組的鈣火花幅度降低(P0.05)、達峰時間延長(P0.05)、持續(xù)時間延長(P0.05)。隨著心衰的發(fā)展,細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,心肌細胞對于電位逐漸反應(yīng)失敏,結(jié)構(gòu)決定現(xiàn)象,鈣火花發(fā)生變化有其結(jié)構(gòu)的改變。6.Western blot檢測結(jié)果心衰模型組大鼠檢測結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,心衰模型組的大鼠在第4周JP2蛋白就表達水平不變(P0.05),第8周模型組蛋白表達低于對照組的蛋白表達(P0.05);隨著心衰的進程發(fā)展,心衰模型組大鼠蛋白表達量逐漸下降(P0.05),到第10周、12周時,蛋白表達沒有差異性(P0.05);對照組間穩(wěn)定表達,沒有差異性(P0.05)。SERCA2a蛋白印記結(jié)果顯示,心衰模型組的大鼠在第4周SERCA2a蛋白就表達水平不變(P0.05),第8周模型組蛋白表達低于對照組的蛋白表達(P0.05);隨著心衰的進程發(fā)展,心衰模型組大鼠蛋白表達量逐漸下降(P0.05),到第10周、12周時,蛋白表達沒有差異性(P0.05);對照組間穩(wěn)定表達,沒有差異性(P0.05)。結(jié)論:1.采用腹主動脈縮窄結(jié)扎可以很好地的復(fù)制大鼠高血壓致心衰模型,與文獻報道的相比,大鼠的成活率高,造模成功率也高。2.心衰模型組大鼠血壓呈規(guī)律變化,血壓在一定時間內(nèi)保持高壓,并在心衰嚴重期有一定的回落;心衰大鼠BNP表達水平隨心衰發(fā)生的嚴重程度逐漸升高。3.心衰發(fā)生后心肌細胞損傷,長桿狀細胞減少。4.發(fā)生心衰的心肌細胞觀測到的鈣火花與正常的鈣火花相比,幅度大小降低、達峰時間及持續(xù)時間明顯延長,提示心肌細胞整個鈣循環(huán)功能受阻,包括鈣激發(fā)與鈣回攝。5.鈣循環(huán)是心肌細胞保證收縮舒張功能的基礎(chǔ),心衰發(fā)生過程中,鈣釋放部位與興奮收縮耦聯(lián)相關(guān)的JP-2蛋白與及肌漿網(wǎng)鈣回攝的SERCA2a蛋白均表現(xiàn)逐步下降,并且蛋白的變化在時間上與鈣火花發(fā)生變化時間相符,兩者發(fā)生變化具有相關(guān)性,提示多種機制發(fā)生造成心衰。
【學(xué)位單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R544.1;R-332;R541.6
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第1章 綜述
    參考文獻
第2章 實驗研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 動物分組
        2.2.2 CHF 模型制備
        2.2.3 大鼠尾動脈壓監(jiān)測
        2.2.4 大鼠 CHF 發(fā)生的標(biāo)志物 BNP 檢測
        2.2.5 單個心室肌細胞的獲取
        2.2.6 Confocal 下鈣信號觀察
        2.2.7 獲得圖像的處理
        2.2.8 Western Blotting
        2.2.9 統(tǒng)計分析
    2.3 實驗結(jié)果
    2.4 討論
    2.5 結(jié)論
    參考文獻
致謝
攻讀碩士期間取得的學(xué)術(shù)成果

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本文編號：2874062