目的:腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病(Chronic Kidney Disease,CKD)進(jìn)行性進(jìn)展的共同病理基礎(chǔ),其病理學(xué)變化是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過多沉積,進(jìn)而導(dǎo)致腎結(jié)構(gòu)的破壞及腎功能的下降。多種細(xì)胞、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞因子均參與該過程。腎間質(zhì)纖維化的早期表現(xiàn)為以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)胞因子、趨化因子增加為主的炎癥狀態(tài)。在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子、生長因子及趨化因子及均可作用于成纖維細(xì)胞(fibroblasts,FB)引起FB增生活躍以及誘導(dǎo)其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,使其合成膠原蛋白能力增加,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積,造成腎臟結(jié)構(gòu)重塑,促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是一種很重要的轉(zhuǎn)錄因子,在各種細(xì)胞外刺激介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中起核心作用,研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子、生長因子及趨化因子的基因表達(dá)是通過該因子轉(zhuǎn)錄機(jī)制來調(diào)節(jié)的,在腎間質(zhì)纖維化過程中,能促進(jìn)多種細(xì)胞因子、生長因子及趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而作用于FB,介導(dǎo)和促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展。NF-κB的活化主要依賴于經(jīng)典途徑:這種途徑依賴IKK(IκB kinase)多聚體磷酸化IκBα(NF-κB抑制蛋白),再通過泛素化降解IκBα,使NF-κB二聚體得以釋放,核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,啟動下游基因轉(zhuǎn)錄,TNF-α等促炎細(xì)胞因子可激活此途徑。IKK是一個大的多組分蛋白激酶復(fù)合體(700KDa),它包括四個組分,即具有催化活性的IKKα/IKK1、IKKβ/IKK2,和兩個輔助蛋白IKKγ/NEMO、IKAP。其中IKKβ是激活NF-κB經(jīng)典途徑的關(guān)鍵亞基,IKKβ可以使IκBα上Ser32和Ser36磷酸化,并誘導(dǎo)其降解,使NF-κB從復(fù)合體中解離后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核啟動下游基因轉(zhuǎn)錄。法舒地爾是一種新型異喹啉磺胺衍生物,是目前應(yīng)用于臨床的Rho激酶抑制劑,其具有擴(kuò)張血管、減少炎癥反應(yīng)、抑制自由基生成等作用,目前廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。有研究顯示:腎間質(zhì)纖維化中,法舒地爾作為Rho激酶抑制劑通路阻斷Rho-ROCK通路對腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用已被研究,有研究顯示其作為異喹啉類抑制劑作用于激酶催化結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點發(fā)揮作用,對其它蛋白激酶也具有選擇性抑制作用,但報道不多,本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^建立單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型(unilateral ureteral obstruction,UUO),并應(yīng)用法舒地爾進(jìn)行干預(yù)觀察其對IKKβ、IκBα、NF-κBP65、III型膠原表達(dá)的影響,探討法舒地爾保護(hù)腎臟,延緩腎間質(zhì)纖維化的可能機(jī)制,為延緩及治療腎間質(zhì)纖維化提供新的靶點。方法:將54只SPF級雄性SD大鼠(體重180g±20g)編號后按照隨機(jī)原則分為三組:A組(假手術(shù)組,正常對照組),B組(單側(cè)輸尿管結(jié)扎組,模型組),C組(法舒地爾組,治療組),每組各18只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行手術(shù)建立單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型,術(shù)前12小時各組大鼠禁食水。三組大鼠均于術(shù)前1天開始給藥,C組給予法舒地爾注射液10mg/(Kg·d)腹腔注射;A組及B組每天給予等容積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。自由攝食水,分別于術(shù)后第3、7、14天處死6只大鼠,留取左腎標(biāo)本,0.9%生理鹽水充分沖洗后取中間1/4固定于4%多聚甲醛中,用于病理切片,應(yīng)用HE和Masson染色技術(shù)觀察光鏡下大鼠腎組織病理改變及腎間質(zhì)纖維化程度,并應(yīng)用免疫組化技術(shù)測定IKKβ、IKBα、NF-KBP65及Ⅲ型膠原在腎臟組織中的表達(dá)。另取部分腎臟組織放入液氮并轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存,用于行western blot檢測NF-κBP65蛋白的表達(dá)。所得實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示統(tǒng)計結(jié)果,應(yīng)用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1大鼠腎臟組織病理學(xué)改變1.1肉眼A組腎臟顏色及大小正常,其余各組大鼠腎臟體積均有不同程度增大,輸尿管擴(kuò)張,腎皮質(zhì)變薄,腎臟及輸尿管內(nèi)有尿液積聚,其中以B組腎臟病變最為明顯。1.2光鏡下HE染色A組:腎組織結(jié)構(gòu)正常,腎小管及間質(zhì)未見明顯異常。B組:術(shù)后第3天,少量炎癥細(xì)胞局部浸潤于腎間質(zhì)區(qū)域,腎小管輕度擴(kuò)張,無明顯纖維組織異常增生;第7天,腎間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤,腎小管擴(kuò)張明顯,并可見腎小管萎縮、塌陷,纖維組織異常增生;第14天,可見更多腎小管萎縮,基底膜完整性破壞。C組:術(shù)后隨時間延長,腎小管間質(zhì)病變逐漸加重,和同期B組相比,腎小管間質(zhì)病變程度有所減輕,但仍明顯重于同期A組。1.3光鏡下Masson染色A組:腎組織相對完整,僅個別區(qū)域有少量膠原纖維。B組:術(shù)后第3天可見腎小管輕度擴(kuò)張,腎間質(zhì)可見少量藍(lán)色膠原纖維沉積,相較于同期A組增多;術(shù)后第7天,腎小管擴(kuò)張明顯,并可見萎縮腎小管,藍(lán)色膠原纖維沉積較術(shù)后3天增多;術(shù)后14天可觀察到藍(lán)色膠原纖維沉積明顯,并且相互交織成網(wǎng)狀。C組:術(shù)后隨時間延長,腎小管間質(zhì)病變及膠原纖維表達(dá)水平進(jìn)行性加重、增多,較同期B組的病變程度稍輕,但仍明顯重于A組。2免疫組化結(jié)果顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),IKKβ、IκBα、NF-κBP65、III型膠原在各組腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)呈陽性表達(dá),其中NF-κBP65在分析中均針對細(xì)胞核中因子的表達(dá)變化。由圖像分析結(jié)果可見B組IKKβ、NF-κBP65、III型膠原在術(shù)后3天、7天、14天在腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)表達(dá)量逐漸增加(P均0.05),各因子分別與同期A組相比表達(dá)增加(P均0.05);B組IκBα隨梗阻時間延長,在腎間質(zhì)表達(dá)量逐漸減少(P均0.05),與同期A組相比表達(dá)減少(P均0.05)。C組IKKβ、NF-κBP65、III型膠原在腎間質(zhì)表達(dá)隨時間延長也逐漸增加(P均0.05),分別與同期B組相比各因子表達(dá)減少(P均0.05),但與同期A組相比,表達(dá)增加(P均0.05);C組IκBα在腎間質(zhì)表達(dá)隨梗阻時間延長逐漸減少(P均0.05),與同期B組相比各因子表達(dá)增多(P均0.05),與同期A組比較,表達(dá)減少(P均0.05)3 western Blot結(jié)果NF-κBP65蛋白:B組目的蛋白的表達(dá)量隨時間延長逐漸增加(P均0.05),與同期A組相比表達(dá)量增加(P均0.05);C組術(shù)后各時期目的蛋白表達(dá)量隨時間延長逐漸增加(P均0.05),與同期B組相比較表達(dá)量減少(P均0.05),但仍高于同期A組(P均0.05)。結(jié)論:1 IKKβ、NF-κBP65、III型膠原在UUO模型梗阻側(cè)腎臟組織中的表達(dá)量增加,且與時間延長呈正相關(guān),而IκBα呈相反變化,提示在腎間質(zhì)纖維化過程中,NF-κB通路被激活,進(jìn)一步介導(dǎo)和促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。2法舒地爾可能通過抑制IKKβ表達(dá),減少IκBα的磷酸化及解離,下調(diào)NF-κBP65的表達(dá),進(jìn)而減輕III型膠原在腎臟的沉積及表達(dá),從而發(fā)揮保護(hù)腎臟,延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展的作用。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R692;R-332
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮寫
前言
材料與方法
結(jié)果
附圖
附表
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述 Rho小G蛋白與腎間質(zhì)纖維化的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷

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1 張成果;;鹽酸法舒地爾對維持性血液透析患者血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2014年21期

本文編號：2864301