肝臟是人類最重要的能量代謝、生物合成和物質轉化器官。嚴重肝臟疾病往往需要原位肝移植(OLT)才能夠獲得根治性的治療,但由于供肝數(shù)量有限、手術復雜且費用高昂等原因原位肝移植手術難以廣泛開展。肝細胞移植具有以下優(yōu)點:①一個供體可給予多個受體提供細胞;②移植技術簡單;③供肝細胞免疫原性低且可凍存;④可重復移植,如移植失敗,對受體的影響也十分微小。但肝細胞移植也面臨人類肝細胞來源有限,而異種移植(Xenotransplantation)免疫排斥反應劇烈等制約因素。肝干細胞具有多向分化能力,可分化為肝細胞與肝非實質細胞,肝干細胞研究的深入開展為肝細胞來源開辟了新途徑。骨髓間充質干細胞(MSC)具有多向分化能力,被稱作肝外源性肝干細胞。MSC在肝內(nèi)可演變?yōu)槁褕A細胞、肝細胞及膽管細胞。MSC的這些特性使利用患者自身MSC進行體外誘導分化,然后自體細胞移植成為可能。從而可以同時解決移植細胞來源匱乏和移植后免疫排斥這兩個肝細胞移植面臨的主要問題。 目的:1.分離人胚胎MSC并體外培養(yǎng),摸索人胚胎MSC的分離、培養(yǎng)方法。2.構建肝損傷合并自身肝細胞再生抑制動物模型。3.將人胚胎MSC移植入自身肝細胞再生抑制的肝損傷大鼠脾臟內(nèi),觀察其在大鼠體內(nèi)的分化演變,為肝細胞移植治療肝衰竭奠定實驗基礎。 材料和方法:1.用密度梯度離心法分離流產(chǎn)胎兒的MSC,用MEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)后檢測人胚胎MSC含量和活性。2.用AAF灌喂大鼠后行肝部分切除,分時段檢測肝功。3.將人胚胎MSC移植到肝損傷合并自身肝細胞再生抑制大鼠脾臟,術后分時段取脾臟、肝臟免疫組化染色了解人ALB、CK 8、CK 18、CK19的表達情況,糖原染色了解細胞內(nèi)糖原含量。 結果:1. 分離獲得的人胚胎MSC含量為85%～93%。體外培養(yǎng)7天后人胚胎MSC含量大于93%,細胞活性在95%以上。2.AAF灌喂后肝損傷大鼠的肝再生抑制明顯,肝功能恢復緩慢。3.人胚胎MSC移植后10天大鼠脾臟的人CK8、CK18、CK19免疫組化染色即可見陽性細胞,移植后2周大鼠脾臟組織內(nèi)人ALB免疫組化染色可見 國家自然科學基金資助(30070347,30100080)。 WP=8 陽性細胞,以后至12周均有陽性顯示。未進行MSC移植的對照組未見陽性細胞。人胚胎MSC移植后大鼠肝臟免疫組化染色結果和脾臟相似,染色陽性細胞主要位于移植后大鼠肝臟的匯管區(qū),這也說明其來源是由脾臟經(jīng)門靜脈進入肝臟。對照組肝臟未見陽性細胞。人胚胎MSC移植后2周大鼠脾臟糖原染色可見陽性,至第12周仍可以檢測到陽性細胞,顯示分化后細胞具有一定的糖原合成能力。 結論: 1.用密度梯度離心法分離后MEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)的人胚胎MSC純度高,生物活性好。 2.AAF灌喂后肝部分切除大鼠肝細胞再生抑制明顯,是較好的肝損傷合并自身肝細胞再生抑制動物模型。 3.人胚胎MSC能夠在自身肝細胞再生抑制的肝損傷大鼠脾臟內(nèi)分化為肝細胞。人胚胎MSC移植后有部分遷移至肝臟,并分化為肝細胞。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

(二)試劑配制0.2% AAF 的配制：將 200mgAAF 粉劑溶于 100m℃冰箱保存。(三)主要儀器設備常用手術器械及大鼠灌喂針 BCD-199 型冰箱 EQU/04-EVC 型超凈臺 7020 型自動生化分析儀 三、肝細胞再生抑制的誘導實驗組大鼠按 10mg/kg.d 的灌喂劑量灌喂 0.2%的 情況，正常喂食。對照組大鼠正常飼喂。四、大鼠部分肝切除手術實驗組、對照組大鼠均行肝左側葉（約占大鼠全肝禁食，術前 2 小時禁水。
【參考文獻】

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本文編號：2857515