樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是一種專職抗原遞呈細胞，能啟動初始T細胞發(fā)生免疫應答，在免疫系統(tǒng)中居于獨特的地位。DC是異質(zhì)性細胞群體，具有不同亞群及不同功能狀態(tài)。成熟DC有很強的免疫激活作用，可啟動初始免疫應答；非成熟DC則顯示出較強的致耐受活性，但這種致耐受活性通常隨DC成熟而轉(zhuǎn)變成免疫原性。目前研究表明，促進DC的成熟與功能，在抗腫瘤及抗感染治療方面意義重大；而抑制DC的成熟，對于在移植排斥反應和自身免疫病中誘導抗原特異性T細胞耐受具有重要意義。所以，有關DC發(fā)育成熟的調(diào)控因素與機制研究，已成為當今免疫學研究的熱點。 α-黑素細胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能的神經(jīng)肽，通過MC1R～MC5R五型受體介導其生物活性。近期研究發(fā)現(xiàn)，在人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞(monocyte-derived dendritic cell，MoDC)上表達有α-MSH受體MC1R。α-MSH能下調(diào)MoDC的CD86、CD40表達，提示α-MSH可能對DC的成熟和功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。而已知腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及新近發(fā)現(xiàn)的表達于髓系細胞的激發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)都可促進DC前體發(fā)育成熟。 基于上述研究，本課題進一步研究了α-MSH對TNF-α或激活TREM-1誘導的MoDC成熟是否有調(diào)節(jié)作用，以及相關的機制如何。 第一部分 α-黑素細胞刺激素對人單核細胞來源的樹突狀細胞成熟的調(diào)節(jié)作用 取健康獻血者的白細胞，用本室已建立的方法從中分離得到單核細胞，聯(lián) 第二軍醫(yī)大學碩士學位論文 合使用GM一CSF及IL4誘導單核細胞分化為MoDC。將培養(yǎng)的MODC分為不 同處理組:僅使用GM一CSF及IL4誘導分化的MoDC;加用TNF一。或激動性 TREM一1抗體刺激的MoDC(TNF一Q處理的MoDC或TREM一1抗體處理的 MoDC);加入a一MSH作用于MoDC(a一MSH處理的MoDC);在每次加TNF一a 或TREM一1抗體Zh前，加入(:一MSH作用于MoDC(a一MSH+TNF一a處理的 MoDC或a一MSH+TREM一1抗體處理的MoDC)。收獲培養(yǎng)第8天的各組MoDC 進行下述實驗:(1)觀察細胞形態(tài)差異;(2) FACS檢測細胞表型和細胞攝取 抗原的能力;(3)混合淋巴細胞培養(yǎng)檢測MoDC刺激同種異體T細胞增殖的 能力;(4)檢測MoDC的抗原遞呈能力;(5) ELISA檢測MoDC產(chǎn)生IL12 的水平。 結(jié)果表明:TNF一a處理的MODC具有成熟DC的特征，與其相比，a一MSH +TNF一Q處理的MoDC樹突不夠明顯，呈單核細胞狀;表面分子CD86、MHC H、CDla及CD83降低;攝取抗原的能力較強;刺激同種異基因淋巴細胞增 殖的能力較弱;向同基因T細胞提呈抗原并刺激其增殖的能力也較弱;分泌 正12降低。說明Q一MSH可抑制TN下一a誘導的MODC成熟。 TREM一1激動性抗體處理的MODC具有成熟DC的特征，與其相比，a一MSH +TREM一1抗體處理的MoDC樹突不夠明顯，表面分子CD86、MHC 11、CDla 及CD83表達下降，提示TREM一1介導的MoDC成熟可被。一MSH抑制。用FACS 檢測了MoDC表達TREM一1的情況，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3天與7天的MoDC表達TREM一1 均較低;將培養(yǎng)7天的DC用廿S刺激24h后，TREM一1表達明顯升高。將培 養(yǎng)7天的Q一MSH處理的MoDC用LPS刺激24h后，TREM一1表達與僅用廿S 刺激相比，上調(diào)幅度減小。表明。一MSH可抑制廿S刺激DC引起的TREM一1 上調(diào)。 第二部分。一黑素細胞刺激素調(diào)節(jié)人單核細胞來源的 樹突狀細胞成熟的機制初探 為了探討Q一MSH抑制TNF一a誘導MODC成熟的機制，本部分實驗中，首 第二軍醫(yī)大學碩士學位論文 先取TNF一Q處理的MODC與。一MSH+TNF一Q處理的MODC進行全蛋白雙向電 泳圖譜分析，發(fā)現(xiàn)兩者間產(chǎn)生差異的蛋白質(zhì)斑點37個。然后對Q一MSH+TNF一a 處理的MoDC表達明顯上調(diào)的3個蛋白質(zhì)斑點進行基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛 行時間質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定，得到膚質(zhì)量指紋圖譜。通過數(shù)據(jù)庫檢索分析，確定 這3個蛋白質(zhì)分別為膜聯(lián)蛋白I(Annexinl)、維甲酸受體相關的孤兒受體一a (retinoid acid reeeptor一relatedo甲han reeeptor一alpha)、胃癌多藥抗性蛋白突變體 (gastrie caneer multi一drug resistanee protein variant)。進一步用Western一Blot方 法檢測了Annexinl的表達水平，證實了Annexin工在Q一MSH+TNF一Q處理的 MODC中表達升高。提示a一MSH抑制TNF一Q誘導MoDC成熟與膜聯(lián)蛋白I、 維甲酸受體相關的孤兒受體、胃癌多藥抗性蛋白突變體表達上調(diào)有關。 已知NF一KB轉(zhuǎn)錄因子在DC的成熟過程中起到重要作用，。一MSH可抑制 不同炎性因子對某些細胞NF一KB的激活。為了探討Q一MSH抑制TNF一a誘導的 MoDC成熟，是否也涉及對NF一KB激活的抑制，故進行了EMSA檢測，結(jié)果 表明:與TNF，a處理的MoDC相比，Q一MSH+TNF一a處理的MODC核蛋白抽 提物中NF一KB與DNA結(jié)合下降，說明Q一MSH可抑制MODC中NF一KB與DNA 的結(jié)合。 本實驗研究發(fā)現(xiàn)Q一MSH對TNF一Q或TREM一1激動性抗體誘導的MoDC成 熟具有抑制作用，其機制與細胞內(nèi)的膜聯(lián)蛋白I、維甲酸受體相關的孤兒受體、 胃癌多藥抗性蛋白突變體表達上調(diào)以及NF一KB與DNA結(jié)合降低有關。本研究 為闡明DC成熟的調(diào)控機制，以及進一步研究以DC為靶標的措施用于防治
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖1一1不同處理的MoDC形態(tài)(x400)ChangesofMoDCmorphologyindifferenttreatmentF一a一treatedMoDC;B:a一MSH+1，NF一a一trti一TREM小treatedMoDC;D:a一MSH+anti一TREM

在抗原提呈功能實驗中，MoDC和T細胞均來自同一獻血者，兩種細胞的MHC一n類分子相同，起作用的僅僅是MoDC提呈的抗原分子，因此這一實驗體現(xiàn)了MoDC的抗原處理、加工和提呈的綜合功能。從圖1一5可以看出，與TNF一a處理的MoDC相比，a.MSH十TNF一a處理的MoDC抗原遞呈功能較低。

2.2MALD卜ToF一MS質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫同源性分析對2一DE凝膠上表達明顯上調(diào)的3個蛋白質(zhì)斑點進行切割，用胰蛋白酶消化后，進行MA工DLTOF一MS檢測，得到膚質(zhì)量指紋圖譜，如圖2一2、2一3以及2一4所示。通過數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合2一DE圖譜上相應蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、PI值，確定這3個蛋白質(zhì)分別為spotl:膜聯(lián)蛋白I(八刀nexinl)、sPotZ:維甲酸受體相關的孤兒受體a(retinoidaeidreeeptor-relatedo印hanreeeptor一alpha，RORa)、spot3:胃癌多藥抗性蛋白突變體(gastrieeaneermulti一drugresistaneeProteinvariant)。表2一1通過2一DE及M泊工Dl一TOF一MS分析。一MSH+TNF一Q處理的MoDC與TNF一a處理的MoDC之間表達差異的蛋白質(zhì)TableZ一1DifferentiallyexPressedMoDCProteinsbetweena一MSH+TNF~a一treatedMoDCandINF一a一treatedMoDC，isolatedandidentifiedbyZ一DEandMALDI一TOF一MSanalysisSPotProteinName材卜/PIIntensityMatchedNo.(%)Allnexinl38714.5/6
【參考文獻】

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1 劉和春,楊春,楊青,張維冰,張玉奎;毛細管等電聚焦/毛細管無膠篩分電泳二維蛋白質(zhì)分離平臺的構(gòu)建[J];分析化學;2004年03期

2 何威;陳愛華;宋旭東;;地爾硫?抑制酶修飾低密度脂蛋白對外周血中樹突狀細胞分化成熟的影響研究[J];中國藥房;2009年13期

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1 沈娟;α-黑素細胞刺激素在實驗性心臟移植中的作用及其機制[D];第二軍醫(yī)大學;2003年

本文編號：2845687