目的 構(gòu)建三株含有hFGF2、hVEGF165、hVEGF121基因的非復制型重組腺病毒，以期用于皮瓣血運障礙的基因治療。方法 以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用原核細胞的同源重組機制構(gòu)建非復制型重組腺病毒。首先設(shè)計引物，通過RT-PCR從Hep-2細胞(喉鱗癌細胞)的總mRNA中擴增得到三個目的基因的cDNA。分別將其重組到克隆載體pGEM-T Easy中，經(jīng)測序證實后，進一步重組到穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV上，獲得分別含有三種不同目的基因的重組穿梭質(zhì)粒。用Pme Ⅰ酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的E.coli BJ5183／p的感受態(tài)細胞，完成同源重組。取陽性克隆、小提質(zhì)粒。再分別轉(zhuǎn)化E.coliDHIOB感受態(tài)細胞，獲得可產(chǎn)生高拷貝質(zhì)粒的E.coli DH10B菌株。采用限制性內(nèi)切酶分析、測序等方法對三種重組腺病毒質(zhì)粒進行鑒定。最后將重組腺病毒質(zhì)粒用Pac Ⅰ酶切，獲得重組腺病毒DNA分子，用脂質(zhì)體法，轉(zhuǎn)染293包裝細胞，得到三種重組腺病毒，并以PCR和RT-PCR法進行進一步鑒定。結(jié)果從Hep-2細胞中通過RT-PCR擴增得到hFGF2、hVEGF165、hVEGF121 cDNA并完成三種目的基因的重組克隆載體pT-hFGF2、pT-hVEGF165、pT-hVEG121和重組穿梭載體pShuttle-CMV-hFGF2，pShuttle-CMV-hVEGF165、pShuttle-CMV-hVEGF121的構(gòu)建和鑒定；完成重組腺病毒質(zhì)粒pAdE-hFGF2、pAdE-hVEGF165、pAdE-hVEGF121的構(gòu)建及鑒定；獲得三株分別含有相應目的基因的重組腺病毒AdE-hFGF2、AdE-hVEGF165、AdE-hVEGF121，PCR法證明三株重組腺病毒中，分別穩(wěn)定地整合有hFGF2、hVEGF165、hVEGF121的基因，用RT-PCR方法分別檢測了三株重組腺病毒感染細胞中的hFGF2、hVEGF165、hVEGF121特異性mRNA，結(jié)果表明這些基因可被有效地轉(zhuǎn)錄。結(jié)論 獲得hFGF2、hVEGF165、hVEGF121三種基因的cDNA和三株含有hFGF2、hVEGF165、hVEGF121基因 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 的重組腺病毒，并經(jīng)鑒定，為皮瓣血運障礙的基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
英文縮略詞
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
綜述
附圖

【共引文獻】

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本文編號：2834003