目的 利用基因工程技術從人扁桃體細胞cDNA中克隆出IL-21編碼基因，將其N末端成熟片段編碼基因在原核細胞中進行融合表達，并進行初步純化和抗原性檢測。 方法 以人扁桃體細胞經(jīng)PHA刺激的cDNA文庫為模板，經(jīng)PCR獲得IL-21全基因片段。測序確認后，分別設計含BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點的引物，經(jīng)PCR獲得IL-21成熟肽的編碼基因。將此IL-21基因插入表達載體pGEX 4T-2并轉化大腸桿菌DH5α，重組克隆經(jīng)酶切與測序確認后進行IPTG誘導表達。用瓊脂糖珠結合的純化和酶切方法，所得產(chǎn)物作蛋白印跡試驗分析。 結果 瓊脂糖凝膠電泳顯示重組質粒的PCR和雙酶切產(chǎn)物與理論大小相等。SDS-PAGE顯示經(jīng)IPTG誘導后的大腸桿菌DH5α亦表達一與理論相符的條帶。目的蛋白約占總菌體蛋白的10％。并獲得了與理論值相符的純化條帶，在進一步的蛋白印跡試驗分析中發(fā)現(xiàn)表達的蛋白能與IL-2的單抗產(chǎn)生交叉反應。 結論 我們構建了人IL-21編碼基因克隆載體并獲得在大腸桿菌中的成功表達，同時建立了該蛋白的初步純化方法，通過免疫印跡實驗進一步揭示了表達蛋白與IL-2之間結構的相似性，結合國外最新研究預示了IL-21作為臨床一種新的調節(jié)免疫功能藥物的潛力。
【學位單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖1PCR產(chǎn)物及重組質粒①DLZ000Marker;②IL一21全長編碼基因;③IL一21成熟N末端編碼基因;④pGEX4T一2空質粒;⑤酶切的pGEX4T一2空質粒;⑥重組成功的pGEX4T一2八L一21質粒測定性(白斑)的IL一21的全長編碼基因克隆送測序部(儀器為ABIP租SM377一%，測別用自帶引物進行測通。測序結果顯示:預期一致，進一步證明重組克隆成功。測序

經(jīng)PcR擴增出的IL一21成熟膚的編碼基因片段，在酶切后插入質粒pGEX4T-2，構建成重組表達質粒。堿裂解法提取重組克隆質粒，首先用PCR初步鑒定重組質粒;然后，將PCR鑒定重組成功的質粒經(jīng)雙酶切后電泳(圖2)。4.重組質粒pGEX4T一2/IL一21在E.eo11DH5a中的表達經(jīng)SDS一PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍R一250染色觀察，含重組質粒的誘導菌在4100oD。位置出現(xiàn)一蛋白條帶，而未誘導的重組質粒轉化菌在相應位置的沒有蛋白條帶;含質粒pGEX4T一2的誘導菌在26000Da位置出現(xiàn)一條帶。目的基因表達的多膚相對分子量估計為150O0Da，與融合蛋白共同表達相對分子質量約為41000Da，與理論估計相一致。經(jīng)凝膠成像掃描，融合蛋白產(chǎn)量占總蛋白的10%。(圖3)圖3重組質粒表達產(chǎn)物的SDS一PAGE①低分子量蛋白marker;②未誘導的空質粒;③未誘導的重組質粒;④誘導的空質粒;⑤一⑦誘導1，2，4h的重組質粒

與理論估計相一致。經(jīng)凝膠成像掃描，融合蛋白產(chǎn)量占總蛋白的10%。(圖3)圖3重組質粒表達產(chǎn)物的SDS一PAGE①低分子量蛋白marker;②未誘導的空質粒;③未誘導的重組質粒;④誘導的空質粒;⑤一⑦誘導1，2，4h的重組質粒

【共引文獻】

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本文編號：2828498