【摘要】：EDAG基因是本實(shí)驗(yàn)室分離克隆的一種與造血細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)的新基因。EDAG基因是從4月齡人胎肝組織與成年肝組織的差異表達(dá)基因EST庫(kù)中分離到的一種新基因片段，mRNA長(zhǎng)約2.2 kb,經(jīng)篩選人胎肝 cDNA文庫(kù)獲1.9kb片段，命名為紅系分化相關(guān)基因（erythroid differentiation-associated gene，EDAG）。序列分析推測(cè)該基因編碼484 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，且在體外實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)，該蛋白定位于染色體9q22。 前期研究表明，EDAG特異表達(dá)于造血組織與胚胎組織，并在白血病細(xì)胞中高表達(dá)。利用反義核酸技術(shù)抑制EDAG表達(dá)后，可以抑制白血病細(xì)胞的增殖能力以及誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的分化能力。在細(xì)胞因子依賴的細(xì)胞株中高表達(dá)EDAG 可使細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的依賴性降低，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗凋亡能力。分子機(jī)制的研究表明，EDAG可以通過(guò)某些途徑活化轉(zhuǎn)錄因子 NF-kappaB，使其入核并激活其下游基因如c-myc，Bcl-2 及Bcl-xL等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。 酵母雙雜交體系是一種采用分子遺傳學(xué)手段、通過(guò)鑒定報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法。為深入研究EDAG基因激活NF-κB的機(jī)制，本研究以EDAG為誘餌蛋白，用酵母雙雜交系統(tǒng)從人骨髓cDNA文庫(kù)中篩選其相互作用蛋白，希望得到一些參與EDAG調(diào)控NF-kappaB通路的相互作用蛋白。 本實(shí)驗(yàn)分以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究： 1．誘餌蛋白pGBKT7-EDAG的構(gòu)建和鑒定 為了篩選EDAG的相互作用蛋白,本研究用PstⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)PMD-EDAG和pGBKT7載體進(jìn)行酶切,將EDAG片段插入到pGBKT7載體中,獲得誘餌蛋白pGBKT7-EDAG。 2．人骨髓文庫(kù)中EDAG相互作用蛋白的篩選 利用酵母雙雜交方法以1.0kb的EDAG作為誘餌蛋白，篩選在人骨髓細(xì)胞中能與EDAG有相互作用的蛋白，這些與EDAG有結(jié)合作用的蛋白可能是EDAG的特異性底物或者是在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)或介導(dǎo)EDAG功能的一些重要介導(dǎo)分子。通過(guò)對(duì)人骨髓文庫(kù)的篩選，一共得到57個(gè)陽(yáng)性克隆。發(fā)現(xiàn)幾個(gè)重要的候選基因，他們編碼的蛋白分別是：THAP11、ABP-280、IL8等。其中THAP11重復(fù)出現(xiàn)10次，本文對(duì)THAP-11的功能進(jìn) WP=68 行了重點(diǎn)研究。其他相互作用分子ABP280、IL8的相關(guān)研究正在進(jìn)行中。 3．THAP11對(duì)NF-κB的抑制及抑制EDAG對(duì)NF-κB的活化 通過(guò)GST-pulldown、co-IP（免疫共沉淀）驗(yàn)證EDAG同THAP-11的相互作用后，通過(guò)報(bào)道基因研究THAP11對(duì)EDAG調(diào)節(jié)NF-κB的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明THAP11不僅抑制NF-κB的活性，而且抑制EDAG對(duì)NF-κB的活化作用，提示THAP11可能是EDAG調(diào)控NF-κB的重要參與蛋白。 4．人骨髓文庫(kù)中THAP11相互作用蛋白的篩選 利用酵母雙雜交方法以THAP11為誘餌蛋白，從人骨髓cDNA文庫(kù)中用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到其與G蛋白具有強(qiáng)烈的相互作用。G蛋白，比如Ras，也參與細(xì)胞的凋亡調(diào)控。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)論是：THAP11是EDAG的重要相互作用蛋白，可能對(duì)EDAG的分子作用機(jī)制有重要的調(diào)控作用。THAP11可以抑制NF-κB的活性，而且可以抑制EDAG對(duì)NF-κB的活化作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2791214