【摘要】： 持續(xù)的嚴重感染是臨床常見的病癥。例如創(chuàng)傷、燒傷、休克等所致的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)通常伴有持續(xù)嚴重的內毒素血癥，引起爆發(fā)性炎癥反應，導致低血壓、局部組織缺血和器官功能衰竭，如處理不及時則常導致病人死亡。這類病人具有明顯特異性免疫功能低下的特征，這也是感染難以控制的原因之一，但其與持續(xù)嚴重內毒素血癥的關系及具體機制尚不清楚。 內毒素(endotoxin)是存在于革蘭氏陰性細菌胞壁外膜中的一種生物活性成分，在革蘭氏陰性細菌感染的發(fā)病機制中起十分重要的作用，其主要毒性成分是脂多糖(lipopolysaccharide LPS)。LPS可以作用于抗原提呈細胞(antigen presenting cells APCs)，例如樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、單核巨噬細胞等，促使它們合成和分泌多種細胞因子和炎癥介質，從而使機體產生多種病變，乃至感染性休克。 DC是目前已知的功能最強的專職抗原提呈細胞，具有刺激初始T細胞增殖的獨特功能。DC按來源可分為髓樣DC(myeloid DC)和淋巴樣DC(lymphoid DC)，分別由骨髓CD34~+干細胞、外周血單核細胞以及淋巴細胞等在�！奘杉毎浯碳ひ蜃�(granulocyte-macrophage clony-stimulating factor，GM-CSF)的誘導下分化而來。出于容易誘導和擴增的原因，目前對于DC的研究主要集中在髓樣DC，我們亦是以髓樣DC為研究對象。成熟的DC表達高水平的Ⅱ類主要組織相容性復合體(MHC-Ⅱ)、共刺激分子(CD80、CD86)以及某些粘附分子等。成熟的DC還可將抗原提呈給T細胞，從而活化T細胞，啟動免疫應答。基于DC的重要功能和在機體特異性免疫中居于的關鍵地位，我們設想持續(xù)嚴重感染時的LPS刺激可能會影響DC的分化發(fā)育和功能的成熟，從而影響機體的特異性免疫功能。 我們用本室已建立的方法分離小鼠骨髓細胞，用GM-CSF誘導其中CD34~+的干細胞分化成不成熟的BMDC。在此過程中用LPS持續(xù)刺激作為試驗組， 第二軍醫(yī)大學碩士學位論文 以模擬體內持續(xù)嚴重感染時LPS長期存在對DC成熟狀態(tài)的影響；同時在培養(yǎng) 過程中不加 LPS作為陰性對照，在培養(yǎng)的最后二天加入LPS作為一次性單次刺 激的對照。培養(yǎng)7天后進行下述實驗：①觀察細胞形態(tài)的差異；②流式細胞儀 檢測細胞表型和細胞攝取抗原的能力：③＊＊ISA檢測細胞產生的細胞因子；④ 混合淋巴細胞培養(yǎng)檢測細胞提呈抗原的能力：⑤H。e。他o3258檢測細胞凋亡水 平：③用Western－blot檢測信號轉導分子的表達水平。結果如下： 一、LPS的持續(xù)刺激對DC表型和功能的影響。 大量研究證實，用一定劑量的LPS短期刺激不成熟的DC，可以誘導DC 成熟。成熟DC表現(xiàn)為細胞突起增多，變長，胞漿中吞噬小泡減少，而溶酶體 豐富，核呈分葉狀；MHC－11、CD86、CD80、CD等表面分子表達升高；攝 取抗原的能力較弱，刺激同種異基因淋巴細胞增殖能力增強。我們的研究發(fā)現(xiàn)， 在用＊M－＊SF誘導骨髓干細胞向＊C分化的早期即持續(xù)予以1卜咖1＊PS刺激， 可以影響DC形態(tài)、表型和功能的成熟，DC呈現(xiàn)不成熟狀態(tài)：胞膜皺稻和突 起少且鈍；表達MHC－11、CD86、CD80、CDllC較成熟DC明顯降低；攝取 抗原（FITC標記的卵清蛋白）的能力較強；刺激同種異基因小鼠 T細胞增殖 的能力明顯較弱；向同基因T細胞提呈抗原并刺激其增殖的能力也較弱。我們 又進一步檢測了LPS持續(xù)刺激對DC分泌細胞因子的影響，結果發(fā)現(xiàn)LPS持續(xù) 刺激的DC產生TNFa，n1 印70）明顯較LPS單次刺激組少。以上結果提 示，LPS持續(xù)刺激可維持DC處于不成熟狀態(tài)。 二、LPS抑制DC成熟的機制。 我們又進一步探討了持續(xù)LPS刺激維持DC于不成熟狀態(tài)的可能機理。我 們首先考慮是否由于成熟DC大量死亡僅保留不成熟DC。用Hoechst33258檢 測發(fā)現(xiàn)，LPS短期刺激發(fā)育晚期的DC，會導致DC細胞核出現(xiàn)大量熒光，而受 LPS持續(xù)刺激的DC胞核僅出現(xiàn)少量熒光。因而提示，LPS持續(xù)刺激DC井不 會導致DC大量死亡。 在信號轉導方面，目前認為LPS是通過DC細胞膜上Toll樣受體4（hR4） 發(fā)揮作用的。TLR4可直接或間接地激活細胞內MAPK、PKC以及NF．h等多 種信號轉導通路，來調節(jié)細胞分化、生長、凋亡等作用。大量研究證實，LPS 短期刺激不成熟DC，可以活化W－IcB�；罨腘F－h(huán)家族成員進入細胞核， 4 第二軍醫(yī)大學碩士學位論文 結合在某些基因操縱子的NF．oh基序上，從而啟動相關基因轉錄，促使DC成 熟。我們則從其余兩條信號轉導途徑入手，用Western—Blot方法檢測了PKCa、 pl、pZ、5、S、n和＜亞型以及MAPK途徑的ERKI、ERKZ和p38MAPK的表 達，發(fā)現(xiàn)僅 PKC個在 LPS持續(xù)刺激的 DC中表達降低，而未能檢出其余各分 子的明顯變化。提示，LPS持續(xù)刺激 DC導致的 DC成熟受抑制與 PKC十有關。 綜上所述，本實驗研究了在LPS持續(xù)刺激下，DC的表型和功能的變化， 發(fā)現(xiàn)LPS持續(xù)刺激分化發(fā)育中的DC，會抑制DC的成熟和抗原提呈功能的發(fā) 揮。而這種
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392
【圖文】：

ERKI(P44lP42)ERKZ(p44lP42)持續(xù)刺激對BMDC表達P38MAPK圖7每張照片中，LPSMAPKs的影響無LPS刺激組;2.LPS單次刺激組;3.LPS持續(xù)刺激組。圖中可以看出，LPs持續(xù)刺激對Dc表達ERKI/2和P38MAPK并無明顯影響。Fig7.EffectsofsustainedLPSstimulationonexPressionofMAPKsinBMDCs1.withoutLPSstimulatinn:2.withsingleLPSatimulation;3.withsustainedLPSstimulation.ThisfigureshowsthatsustainedLPSstimulationdoesnotsignifieantlya月七cttheexPressionofMAPKsofBMDCs.PKC各亞型表達水平的W七stem一blot檢測鑒于沒有在MAPK途徑中找到證據，我們于是決定在PKC途徑中尋找可能的答案。目前，越來越多的文獻報導，PKC途徑參與DC的分化、成熟和功能發(fā)揮[l4]。本實驗室原有的實驗結果也證實其在被LPS致敏的巨噬細胞中表達

屯p一actinPS持續(xù)刺激對BMDCPKC七種亞型表達水平的影響片中:1.無LPS刺激組;2.LPS單次刺激組;3.LPS持主要亞型中，只有pl在LPS持續(xù)刺激下表達下降。另有7種亞型的表達均沒有明顯影響。ffectsofsustainedLPSstimulationonexPressionof7PKCoutLPSstimulation;2.withsingleLPSstimulation;3.witation.ThisfigureshowsthatsustainedLPSstimulationdoionofPKC一pl.Inaddltion，singleLPSstimulationdoesnotsPressionofanyofthe7PKCsubtyPes.

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 王志剛;LPS刺激的小鼠骨髓來源樹突狀細胞生長和細胞周期分析[D];第二軍醫(yī)大學;2005年

本文編號：2789683