發(fā)布時(shí)間：2020-08-11 16:17

【摘要】： 研究背景及目的 人類白細(xì)胞抗原(HLA)是迄今發(fā)現(xiàn)的人類最復(fù)雜，最具多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)。2001年2月召開的十三屆國(guó)際組織相容性專題會(huì)議確定已發(fā)現(xiàn)的HLA等位基因已達(dá)到1340個(gè)。HLA系統(tǒng)在抗原識(shí)別與呈遞、免疫應(yīng)答與調(diào)控等方面起著極其重要的作用，是影響器官移植物長(zhǎng)期存活和造血干細(xì)胞移植成敗的關(guān)鍵因素之一�，F(xiàn)階段HLA分型，臨床上多采用血清學(xué)分型方法。但血清學(xué)方法不僅存在著廣泛的交叉反應(yīng)和難以找到理想的抗血清而出現(xiàn)技術(shù)上的困難和分型判斷誤差，還會(huì)有許多新發(fā)現(xiàn)的等位基因卻缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，導(dǎo)致個(gè)別基因型無法檢出。以1996年第12屆國(guó)際組織相容性專題研討會(huì)為標(biāo)志，HLA的分型技術(shù)全面進(jìn)入DNA分型階段。 現(xiàn)今國(guó)際上較常采用PCR-SSP和PCR-SSOP對(duì)HLA單個(gè)等位基因位點(diǎn)分型，其準(zhǔn)確性雖優(yōu)于血清學(xué)方法，但操作極為繁瑣，不適合大樣本檢測(cè)�；蛐酒墙臧l(fā)展起來的一種具高通量、集成化為特點(diǎn)的檢測(cè)平臺(tái)，其優(yōu)勢(shì)極其適合多態(tài)性復(fù)雜的HLA系統(tǒng)分型研究。目前國(guó)內(nèi)外此方面的報(bào)道諸多，但尚沒有成熟的HLA分型芯片問世。本研究使用本實(shí)驗(yàn)室建立的技術(shù)流程制作寡核苷酸芯片，對(duì)HLA-DQA1位點(diǎn)進(jìn)行等位基因分型檢測(cè)，旨在建立一套成熟的寡核苷酸芯片分型技術(shù)，用于復(fù)雜的HLA系統(tǒng)的分型研究。 材料與方法 1．人全血基因組DNA的提取 采用改良的酚/氯仿法，以分光光度法檢測(cè)提取的基因組DNA的濃度及純度 2．樣本靶序列的PCR擴(kuò)增 在HLA-DQA1第二外顯子保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并在正義鏈引物5’作FITC標(biāo)記，以熒光標(biāo)記單鏈為優(yōu)勢(shì)鏈，行不對(duì)稱擴(kuò)增。 3．寡核苷酸探針的制備 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫新近公布的HLA-DQA1等位基因序列，設(shè)計(jì)四組共16條特異性寡核苷酸分型探針，并在各5’端做氨基修飾。以預(yù)先摸索的優(yōu)化條件重懸冷凍干燥的探針。 4．基片的處理和制備 取蓋玻片，鉻酸洗液中浸泡過夜，洗凈，NaOH 浸泡，丙酮化，手臂分子連接，清洗，烘烤固定，醛基修飾。 5.寡核昔酸微陣列的制備以同等濃度的反義鏈引物咫作為陽性對(duì) 照，以探針緩沖液作為空白對(duì)照，以無關(guān)探針作為陰性對(duì)照，與制備好的16 條寡核昔酸探針，同時(shí)加人384孔板。使用生物芯片點(diǎn)樣儀，制成預(yù)先設(shè)計(jì) 好的微陣列。點(diǎn)樣后水化、烤干固定，備用。 6.封閉與核酸分子雜交按本室方法，將制備好的寡核昔酸微陣列，清 洗，封閉。PCR產(chǎn)物加雜交液稀釋混勻，覆蓋于各微陣列，置人雜交艙中 55℃保溫3Omin。 7.洗滌與檢測(cè)分析取出雜交芯片，沖去蓋片。用預(yù)熱至60℃的洗 液，即1 xSSC/0.1%SDS，O.sxSSC/0.1%SDS，0.lxSSC行梯度洗滌， ddHZO洗凈吹干。掃描儀檢測(cè)，CCD成像系統(tǒng)分析雜交信號(hào)，確定分型結(jié) 果。 結(jié)果 1.HLA一DQAI基因片段的PCR擴(kuò)增 以提取的全基因組DNA為模板，行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用聚丙烯酞胺凝膠 電泳檢測(cè)，可見條帶清晰，產(chǎn)物長(zhǎng)度538bp，與設(shè)計(jì)相符。 2.寡核昔酸探針制備條件的優(yōu)化 以PH二9，0.IM的碳酸鹽緩沖液，重懸為100林M探針為最優(yōu)條件。 3寡核營(yíng)酸芯片分型結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性 分型結(jié)果與DNA測(cè)序相符合，重復(fù)5次雜交重現(xiàn)率91 .2%。 結(jié)論 基甲芯片作為一種新興的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，具有明顯的高通量、集成化并 行檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，且結(jié)果直觀，易于保存和攜帶，非常適合組成復(fù)雜的HLA系 統(tǒng)的分型檢測(cè)。有關(guān)文獻(xiàn)提示，本室研制的寡核昔酸芯片制作流程相對(duì)簡(jiǎn) 單，易于操作，且穩(wěn)定性好，特異性和靈敏性都能滿足基因分型的需要，是適 合廣泛應(yīng)用的技術(shù)平臺(tái)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：Q789

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 林源,闕庭志,李莉,趙珍敏,周月琴;用反相雜交技術(shù)對(duì)HLA-DQA1基因分型及其應(yīng)用[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2000年01期

本文編號(hào)：2789288