發(fā)布時(shí)間：2020-08-07 22:22

【摘要】：痢疾桿菌是一類通過侵襲入腸道上皮細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制從而導(dǎo)致人類出現(xiàn)腹瀉的革蘭氏陰性細(xì)菌。主要傳播途徑為糞口途徑,由于感染劑量極低(10-100個(gè)菌),所以最長(zhǎng)見的擴(kuò)散形式是人與人之間的傳播。據(jù)保守估計(jì),全世界每年的感染人數(shù)約1.647億,發(fā)展中國(guó)家有約1.632億人次。每年死亡人數(shù)有110萬。在發(fā)展中國(guó)家中福氏痢疾2a血清型占大多數(shù)。由于人們對(duì)痢疾桿菌的致病機(jī)理和宿主的免疫保護(hù)機(jī)制還不十分清楚,所以迄今為止仍未研究出能有效控制痢疾較為理想的疫苗。 本文首先使用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)手段對(duì)痢疾桿菌福氏2a 2457T株可能存在的抗原進(jìn)行篩選和鑒定。分別提取了全菌體蛋白、膜蛋白、外膜蛋白以及胞外分泌蛋白,進(jìn)行了不同pH梯度的雙向電泳。對(duì)于痢疾桿菌的外膜蛋白建立了雙向電泳參考圖譜,通過軟件分析在pH4-7 18厘米膠上計(jì)算出共126個(gè)點(diǎn),其中109個(gè)進(jìn)行膠內(nèi)酶切并MALDI-TOF鑒定出87個(gè),代表55種蛋白。結(jié)合根據(jù)基因組預(yù)測(cè)的外膜蛋白對(duì)鑒定的所有蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)/分子量吻合程度、分布以及功能分類等進(jìn)行了初步的分析。使用免疫家兔的血清,對(duì)不同組分的蛋白樣品進(jìn)行免疫印跡的研究,共找到23種蛋白質(zhì)抗原,其中8種是已知抗原,15種為新抗原。有一個(gè)假想蛋白YaeT,功能未知,序列與Haemophilus influenzae的表面抗原D15以及Pasteurella multocida的oma87基因同源,免疫反應(yīng)很強(qiáng)。有報(bào)道該基因在模擬的體內(nèi)環(huán)境中轉(zhuǎn)錄水平提高,推測(cè)可能與痢疾桿菌的侵襲能力有關(guān),值得進(jìn)一步深入研究。 痢疾桿菌毒力的表達(dá)是溫度相關(guān)的。當(dāng)在37℃培養(yǎng)時(shí)痢疾桿菌表現(xiàn)出完整的毒性以及對(duì)Henle細(xì)胞的侵襲力,但是在30℃培養(yǎng)時(shí)則明顯減毒及喪失侵襲力。本實(shí)驗(yàn)在以前工作的基礎(chǔ)上改進(jìn)方法,對(duì)30℃及37℃培養(yǎng)時(shí)菌體蛋白進(jìn)行了雙向電泳的比較,找到59個(gè)差異蛋白點(diǎn),對(duì)應(yīng)于53種蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示,在30℃培養(yǎng)時(shí)檢測(cè)到42種蛋白上調(diào),12種蛋白下調(diào)(TufB既上調(diào)又下調(diào))。通過對(duì)結(jié)果的分析,推測(cè)莊30℃培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌的乙醛酸循環(huán)增強(qiáng),蛋白質(zhì)合成加強(qiáng)以及嘌呤合成的增加。其中莊免疫蛋白質(zhì)組學(xué)工作中檢測(cè)到的假想蛋白YaeT表達(dá)量也出現(xiàn)增加。 由于在電泳圖譜上ArgT的變化十分顯著,而在大腸桿菌中人工強(qiáng)制表達(dá)時(shí)不論在30℃還是37℃培養(yǎng)時(shí)均可以獲得高表達(dá),但是在痢疾桿菌中表達(dá)時(shí)則只有在30℃時(shí)可獲得高表達(dá)。因此我們使用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了argT失活的突變體,在30℃和37℃培養(yǎng)條件下分別與原始的2457T株進(jìn)行雙向電泳圖譜的比較并得到了一些差異
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

AU圖2:24s7T全菌體蛋白使用pH4.s一pHs.s膠條電泳及WesternBlotting結(jié)果。ApH4.5一pHS.5雙向電泳銀染色圖，100陀上樣量;BpH4.5一pHS.5雙向電泳，WeB10tting，lmg上樣量。其它實(shí)驗(yàn)條件參見圖1。表1全菌蛋白中鑒定出的有免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)SPotIDProteinCommonNameGeneSymbolNCBIGlldentlfiC「FUnCt一onMa一nro!eoctlAPatgvaloafR的IR085R(洲)2R003R004R〕)8ROI4Rol6R037R《洲)5R】71ehapeorneHsP70:autoerguladetheatshockPoretindnaK91}30061584Proet一nt’ateGroEL，ehapeorneHs兩0，pePtide一ependent肖】、Pase，heatshockPorteinmoPA91130065518PortelnafteOuetrmembranechannell’oICeellularPorcesses91130僅抖385

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博絲魚絲第一部分245T7的絲夔迥竺圖3:2457T斯亮藍(lán)染色，膜蛋白雙向電泳以及westernBloftnig結(jié)果·ApH4一7雙向電泳，lmg上樣量;BpH4一7雙向電泳，wcsternBlotting，1mg上樣量。考馬水化12小時(shí)，500VI小時(shí)，1000VI小時(shí)，8000V至總伏小時(shí)數(shù)為50000Vhs。水化液與裂解液均為7MUera/ZMThiourea/4%CHAPS/60mMDTT/0.5%IPGBueffr。bl一6703520032551‘a(chǎn)—只100飛M曰Elt319[已內(nèi)9964了

AB圖5:2457T外膜蛋白不同pH梯度雙向電泳圖譜。ApH3一10;BpH4一7。裂解液與水化液均為SMUrea/ZMThiourea/2%CHAPS/2%SB3一10/50mMDTT/.05%PIGBueffr。電泳條件:1scm膠條，.0smg上樣量，靜置水化6小時(shí)，30V6小時(shí)，500VI小時(shí)，1000VI小時(shí)，8000V至總伏小時(shí)數(shù)為50000VhS。

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉先凱;高美琴;孫忠科;馮爾玲;朱力;王恒j;;弗氏2a志賀氏菌2457T株YciD蛋白的融合表達(dá)和純化[J];生物技術(shù)通訊;2009年01期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 劉小青;福氏2a志賀氏菌2457T的cobB，gtrⅡ和yciD基因功能的研究[D];南昌大學(xué);2010年

2 毛穎;馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株免疫蛋白組學(xué)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

3 王斌;甲型副傷寒沙門氏菌CMCC 50973外膜蛋白的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

本文編號(hào)：2784603