【摘要】： 本實驗的目的是通過半套式RT-PCR擴增甲亢(Graves病)患者樣品單個核細胞中抗體可變區(qū)編碼基因V_H，V_L，并運用重疊伸展PCR技術(shù)將連接序列(Gly_3Ser)_3組裝成單鏈基因(Scfv)并克隆到噬菌體中建立TRAb(促甲狀腺激素受體抗體)單鏈噬菌體抗體基因組合文庫。為進一步，篩選人源TSAb(甲狀腺刺激抗體)，TSBAb(促甲狀腺激素受體阻斷抗體)．抗體活性片段打下基礎(chǔ)。 方法：(1)TRAb單鏈抗體基因(ScFv)的構(gòu)建：從TRAb，TSI均陽性Grave’s病患者的外周血中分離單個核細胞，提取mRNA。并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別以人Vκ5’可變區(qū)兼并引物(與第一骨架區(qū)互補)，人Vκ3’兼并引物(部分與J段互補)PCR擴增抗體輕(V_L)鏈可變區(qū)基因。以人V_H5’兼并引物(與第一骨架區(qū)互補)，人V_H3’可變區(qū)兼并引物(與J段互補)PCR擴增抗體重(V_H)鏈可變區(qū)基因。然后，用重疊剪切PCR(SOE)方法，將V_H和V_L用一個linker(人工合成的36個寡核苷酸序列)連接起來(V_L-linker-V_H)，構(gòu)建人單鏈抗體庫(single chain Fv fragments，ScFv)的基因。 本實驗結(jié)果：PCR產(chǎn)物經(jīng)1.7％瓊脂糖凝膠鑒定，分別在420bp和380bp左右見到V_H和V_L擴增帶，與文獻報道的基本一致，也證明所用的兼并引物有效。V_L-linker-V_H的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.7％瓊脂糖凝膠鑒定，可見在800bp左右見到擴增帶，與假設(shè)相符，證明用SOE法將抗體輕中重鏈可變區(qū)基因通過一27個核苷酸的linker連接起來是成功的。 (2)人TRAb單鏈噬菌體抗體庫的構(gòu)建。將V_L-linker-V_H和p3SCMH分別進行雙酶切并進行連接，并將此重組噬菌粒電轉(zhuǎn)化入 E.coli XL1-blue中。為了精確的對DNA定量，我們采取了紫外DNA吸收光譜值和電泳下熒光亮度相結(jié)合的方法。在電轉(zhuǎn)化的過程中，我們優(yōu)化了電壓、電容、受體菌濃度及轉(zhuǎn)化子量以期獲得最大的庫容。取出少量樣本，鋪于SB雙抗板中以判斷庫容(我們的庫容單位是單個ScFv重組子)。實驗結(jié)果是令人鼓舞的，3.6×10~6庫 容能夠滿足后續(xù)實驗的要求。加人輔助噬菌體VCS一M13后，上清經(jīng)過收集， 離心及重懸，既可得到ScFv抗體庫(也就是噬菌粒庫)。噬菌體抗體庫滴度 (CFU)為4.2X一。，4e刊zml。此滴度也符合要求。 因此可以得到如下結(jié)論: 1.本實驗所用的分別針對輕重鏈可變區(qū)基因的兼并引物能夠擴增出單一的 區(qū)帶，與相關(guān)文獻報道相符，證明這二對引物是有效的。soE是隨機將二個PCR 產(chǎn)物片段連接在一起的一種省時，有效的方法。 2.本實驗的難點是如何用電轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建相對大的庫容。我們經(jīng)反復 優(yōu)化相關(guān)影響因素，進一步提高了DNA提取質(zhì)量及精確的DNA定量，終于 較理想的達到了預期的庫容。為下一步TRAb的篩選打下了堅實的基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392

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本文編號：2769309