【摘要】：外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫(Fatal bacteria granuloma after truma,FBGT)是一種病程短、致死率高的新疾病，21世紀(jì)前還未被皮膚病學(xué)界所認(rèn)識(shí)，直至1996年才由西京醫(yī)院皮膚科發(fā)現(xiàn)并命名。 多個(gè)病人的皮損行透射電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞內(nèi)外存在類(lèi)似短桿菌，將患者皮損組織行多次嚴(yán)格的細(xì)菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)致病菌為一種革蘭陽(yáng)性厭氧短桿菌，細(xì)菌生化鑒定支持本致病菌為痤瘡丙酸桿菌(propionibacteria aches, P.acnes)或放線(xiàn)菌，而API系統(tǒng)鑒定為P.acnes，并且根據(jù)該致病菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果挽救了一例患者。 1．外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫致病菌分子生物學(xué)鑒定 通常認(rèn)為P.aches是一種皮膚的常駐菌群，其致病力很低，但在FBGT中可以引起患者死亡，這一點(diǎn)和已知P.acnes特性不符合，隨之出現(xiàn)一個(gè)問(wèn)題，從FBGT皮損中分離出來(lái)的致病菌是否確實(shí)是P.acnes?雖然API系統(tǒng)鑒定為P.acnes，但該致病菌生化鑒定難以確定其種屬，有必要進(jìn)行深入研究，明確其分類(lèi)。 現(xiàn)代微生物學(xué)提出的多相分類(lèi)(polyphasic taxonomy)， 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 包含表型、基因、系統(tǒng)發(fā)育等信息，是研究細(xì)菌分類(lèi)的最有效手 段，其中，165 rRNA序列測(cè)定可以判定系統(tǒng)發(fā)育信息，適用于細(xì) 菌的各級(jí)分類(lèi)[5]，而DNA一DNA雜交可以確定DNA同源性，是確定 正確分類(lèi)地位的重要方法〔6]。同樣，這些方法也可以用來(lái)對(duì)未知細(xì) 菌進(jìn)行鑒定，確定其種屬。 我們對(duì)于FBGT皮損中分離出的致病菌進(jìn)行165 rRNA序列測(cè) 定，并將測(cè)序結(jié)果在Genebank中進(jìn)行 Blast分析，與國(guó)外報(bào)道的P. aeneS16S rRNA序列同源性達(dá)到99.9%，確認(rèn)其為P.acnes。 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤，我們又進(jìn)一步委托中國(guó)科學(xué)院微生 物所將該致病菌和P.acnes標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行DNA一DNA雜交，結(jié)果顯 示兩者DNA同源性)70%，可以確定兩者為同一種細(xì)菌。 上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)FBGT患者皮損中分離出的致病菌為P.acnes。 2.外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫動(dòng)物模型初步構(gòu)建 FBGT作為一種感染性疾病，深入研究其發(fā)病機(jī)理，探索其治 療措施離不開(kāi)動(dòng)物模型的支持，因此構(gòu)建本病動(dòng)物模型成為深入 研究本病的關(guān)鍵。 構(gòu)建細(xì)菌感染動(dòng)物模型的成功標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)際上公認(rèn)的是郭霍定律Iv] (K0ch’ 5 Postulates)，其基本內(nèi)容是:1.微生物只存在于患病的動(dòng) 物體內(nèi)，在健康動(dòng)物體內(nèi)不存在;2.微生物必須從動(dòng)物體內(nèi)分離培養(yǎng) 出來(lái);3.接種純培養(yǎng)微生物到健康動(dòng)物體內(nèi)可以致病;4.注射微生 物后動(dòng)物出現(xiàn)病變，再一次分離培養(yǎng)出原來(lái)致病菌。 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇家兔進(jìn)行研究。 采取的實(shí)驗(yàn)方法主要是:首先利用皮質(zhì)激素制造家兔的免疫 抑制狀態(tài)，然后將純培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期致病菌及P.acnes標(biāo)準(zhǔn) 株配制成細(xì)菌懸液，注射入家兔皮內(nèi)，觀察注射部位的反應(yīng)及實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物的全身情況。將注射部位出現(xiàn)的皮損分別行組織病理、電 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 鏡檢查及細(xì)菌培養(yǎng):并對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)菌行API鑒定及165 rRNA 序列分析，并根據(jù)臨床資料選擇不同類(lèi)藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn);部分 出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的動(dòng)物及時(shí)行MRI檢查，并取其腦組織進(jìn)行組 織病理、電鏡檢查及細(xì)菌培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有家兔注射部位出現(xiàn)紅斑，注射低濃度(1 x106/mL)細(xì)菌的紅斑數(shù)日內(nèi)消失，而注射高濃度(9 xlo勺mL) 細(xì)菌導(dǎo)致的紅斑則持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，部分發(fā)展為膿腫，可以從皮內(nèi) 膿腫中再一次分離培養(yǎng)出革蘭陽(yáng)性短桿菌;兩組共5只家兔出現(xiàn) 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(單側(cè)眼球突出或下肢癱瘓等)，其中注射高濃度 標(biāo)準(zhǔn)株的有2只，而注射高濃度P.acnes臨床株的有3只，說(shuō) 明P.acnes標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株均可在家兔身上致病。 注射P.acnes臨床株的家兔有l(wèi)只在初次注射兩周后死亡， 未查明其死亡原因;其余4只出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的家兔的背部注 射部位也同樣出現(xiàn)紅斑膿腫，但其頭皮注射部位的紅斑在第一次 注射4周左右逐漸消退，變?yōu)橘|(zhì)地較硬的結(jié)節(jié)，組織病理發(fā)現(xiàn)多 核巨細(xì)胞聚集，在一定程度上類(lèi)似FBGT患者的組織病理結(jié)果; 出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的家兔腦組織病理結(jié)果為腦水腫明顯，有較多 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見(jiàn)多核巨細(xì)胞，腦組織未培養(yǎng)出所注射細(xì)菌。 從家兔皮損中分離出的細(xì)菌傳代分離純菌，行API鑒定及165 rRNA序列測(cè)定均符合P.acnes。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合郭霍定律，構(gòu)建成 功FBGT動(dòng)物模型。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)FBGT的致病菌是P.acnes，加深了對(duì)FBGT 的認(rèn)識(shí);并利用家兔構(gòu)建成功FBGT的動(dòng)物模型，為進(jìn)一步深入 研究本病的發(fā)病機(jī)理打下了一定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)構(gòu)建更加 完備的動(dòng)物模型有一定啟示。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【圖文】：

1.3.1.1165rRNA基因PCR產(chǎn)物提取細(xì)菌DNA后，利用所設(shè)計(jì)165rRNA引物行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行電泳發(fā)現(xiàn)在約1500bp左右出現(xiàn)明顯條帶(圖1一A)，證實(shí)提取成功。

一A:注射后1日出現(xiàn)紅斑;

并且注射9x105/mL細(xì)菌懸液組部分皮損出現(xiàn)破潰、流膿，但注射lx106/mL細(xì)菌懸液組內(nèi)各家兔均未出現(xiàn)破潰流膿。圖2一A:注射后1日出現(xiàn)紅斑;圖2一B:注射后3日，紅斑達(dá)到最大，周?chē)式䴘?rùn)性;

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本文編號(hào)：2744785