【摘要】：登革病毒(dengue virus)是人類登革熱(DF)、登革出血熱／登革休克綜合征(DHF／DSS)的病原體。自上世紀(jì)80年代以來，登革熱和登革出血熱在世界范圍內(nèi)的暴發(fā)流行日益頻繁。尤其是在熱帶及亞熱帶地區(qū)，登革病毒感染導(dǎo)致的發(fā)病率及病死率急劇上升。登革熱亦是我國一種嚴(yán)重的蚊媒傳播性病毒病，我國南方及東南沿海各省區(qū)均為登革熱流行區(qū)。 登革病毒感染嚴(yán)重威脅全球近半數(shù)人的健康，然而時(shí)至今日仍然沒有有效的治療藥物和疫苗。因而探索抗登革病毒感染的新策略成為當(dāng)今登革研究的熱點(diǎn)。衣殼蛋白靶向病毒滅活(capsid targeted viral inactivation；CTVI)是近年來新興的基于蛋白水平的抗病毒策略，與目前流行的流行的基于核苷酸水平的策略(如RNAi，反義核酸，核酶等)具有特異、高效、不易產(chǎn)生突變株等優(yōu)點(diǎn)。將CTVI策略應(yīng)用于抗登革病毒感染充滿了吸引力。 登革病毒衣殼蛋白位于位于病毒顆粒的內(nèi)部，并不誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，因而對(duì)其研究較少，同時(shí)其加工過程中無需糖基化，因而我們首先在大腸桿菌中對(duì)登革2型病毒衣殼蛋白(D2C)及其前體(D2C_I)進(jìn)行了表達(dá)。結(jié)果表明表達(dá)的D2C及D2C_I均能被抗登革2型病毒衣殼蛋白單克隆抗體特異識(shí)別，相對(duì)分子量大小分別為11和13KD，與DNAstar軟件包分析一致。利用重組表達(dá)的衣殼蛋白我們對(duì)其體外自組裝活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明無論是成熟的衣殼蛋白還是其前體均不能自組裝形成衣殼樣顆粒。利用ProteinPredict軟件包對(duì)登革2型病毒43株衣殼蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：存在一個(gè)高度疏水區(qū)，Blast分析顯示該區(qū)域高度保守；存在4個(gè)α螺旋和2個(gè)正電荷富集區(qū)。同時(shí)，利用大腸桿菌GI724／pLEX表達(dá)系統(tǒng)對(duì)葡萄球菌核酸酶(staphylococcal nuclease；SN)進(jìn)行了表達(dá)。結(jié)果表明重組表達(dá)的SN相對(duì)分子量大小約為17kD，表達(dá)的目的蛋白占菌體蛋白總量37％。將重 摘要 組表達(dá)的SN蛋白免疫日本大耳白兔，制備了抗SN多克隆抗體， Westem Blot分析顯示制備的多克隆抗體具有良好的特異性，為后續(xù)研 究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 為了研究登革病毒衣殼蛋白靶向核酸酶作為抗病毒因子的可行 J險(xiǎn)，我們首先構(gòu)建了登革2型病毒衣殼蛋白靶向葡萄球菌核酸酶融合 蛋白DZC一SN，原核表達(dá)的DZC一SN相對(duì)分子量大小約為3OkD，具有 良好的抗原性，可被抗DZC抗體特異識(shí)別;同時(shí)具有良好的核酸酶活 性，能夠?qū)NA進(jìn)行切割。這些結(jié)果表明與DZC融合表達(dá)的SN能夠 正確折疊并具有良好的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步探討登革病毒衣殼蛋白 靶向抗病毒作用的研究奠定了基礎(chǔ)。 在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了表達(dá)DZC一SN的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺 乳動(dòng)物細(xì)胞系BHKZI后，經(jīng)壓力篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)DZC一SN的細(xì)胞 系，說明DZC一SN對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞不具毒性，與MTT分析結(jié)果一致。 真核表達(dá)DZC一SN能夠?yàn)榭笵ZC及 SN的特異抗體識(shí)別，分子量大小 與原核表達(dá)基本一致(3 okD)，DNA消化試驗(yàn)表明DZc一sN具有良好的 核酸酶活性。將穩(wěn)定表達(dá)DZC一sN的細(xì)胞系命名為pc/DZc一sN，同時(shí) 獲得了對(duì)照細(xì)胞系pc/DZC一SN*。然后以我國登革2型病毒分離株DZ一43 分別感染該兩種細(xì)胞系及正常BHKZI細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清中產(chǎn)生 的子代病毒，分別研究其感染性及對(duì)乳鼠的致病性，是為預(yù)防模型。 對(duì)于業(yè)以感染登革病毒的細(xì)胞，通過陽離子轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒導(dǎo)入 細(xì)胞，收集子代病毒并分析其感染性，是為治療模型。結(jié)果表明DZC一SN 呈現(xiàn)出良好的抗病毒效果:在治療模型中導(dǎo)致子代病毒感染性降低 12~60倍，在預(yù)防模型中感染性降低倍數(shù)高達(dá)1護(hù)一104。而核酸酶活性 缺失突變體對(duì)照DZC一SN*僅觀察到輕微的抗病毒效果(感染性降低 1.5一巧倍)，說明子代病毒感染性的降低主要是由于靶向核酸酶 DZC一SN的核酸酶活性所致。為分析DZC一SN抗病毒作用的確切機(jī)制， 我們收集各細(xì)胞系中產(chǎn)生的子代病毒顆粒進(jìn)行Westem Blot分析，結(jié) 果表明自BHK/DZC一sN及BHK/DZc一SN*細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒顆粒中均 可檢測到SN及SN*的存在，說明DZC一SN在病毒組裝過程中被共同裝 ，l匕 摘要 配入子代病毒顆粒內(nèi)部。DNA消化試驗(yàn)表明，裝配入子代病毒顆粒內(nèi) 部的sN具有良好的核酸酶活性，能夠降解病毒基因組。進(jìn)一步我們采 用RT一PCR的方法分析了子代病毒完整基因組含量，結(jié)果表明 BHK/DZC一SN細(xì)胞中產(chǎn)生的子代病毒顆粒中完整基因組含量與正常 BHKZI細(xì)胞相比降低倍數(shù)在1護(hù)以上，與感染性降低倍數(shù)基本吻合。 這說明DZC一SN的抗病毒效果并非降低子代病毒顆粒的數(shù)量，而是通 過降解病毒基因組從而導(dǎo)致病毒感染性喪失。 總之，我們首次在細(xì)胞水平上證實(shí)了CTVI策略應(yīng)用于抗登革病 毒感染的可行性，隨著體內(nèi)研究及相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，CTVI必將成 為抗人類登革病毒感染的有力武器。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2739282