【摘要】：目的構(gòu)建一種具有生物學(xué)活性的血管活性腸肽(VIP)的真核表達(dá)質(zhì)粒。方法利用RT-PCR從小鼠胸腺淋巴細(xì)胞中克隆有信號(hào)肽序列的VIPcDNA,插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1,構(gòu)建含VIP的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VIP,轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,用ELISA和Westernblot鑒定表達(dá)的蛋白,細(xì)胞因子釋放抑制法測(cè)定生物學(xué)活性。結(jié)果經(jīng)酶切和基因測(cè)序證實(shí),克隆的基因片段為帶有信號(hào)肽序列的VIP基因;經(jīng)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞表達(dá)VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬細(xì)胞的TNF-α釋放。結(jié)論成功構(gòu)建了能夠表達(dá)具有生物學(xué)活性的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-VIP。
【圖文】：

EcoRⅠ雙酶切后,在約160 bp處得到一片段,符合插入的目的片段長(zhǎng)度,另一大片段產(chǎn)物為切開的pcDNA3.1質(zhì)粒DNA(圖2)。重組pcDNA3.1-VIP進(jìn)一步經(jīng)測(cè)序證實(shí),插入片段為帶有信號(hào)肽的VIP cDNA(圖3)。·149·第2期張松照,等.血管活性腸肽真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定　　

的瞬時(shí)表達(dá)　Westorn blot分析結(jié)果表明經(jīng)pcDNA3.1-VIP轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞及其培養(yǎng)上清中均有VIP多肽的存在(圖4); ELISA結(jié)果顯示培養(yǎng)上清中VIP含量達(dá)1 ng/ml。而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1的細(xì)胞及上清液中均未見有VIP產(chǎn)物的表達(dá)。這說(shuō)明帶有信號(hào)肽的VIP重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物可分泌至胞外。2.4　表達(dá)產(chǎn)物VIP蛋白的生物學(xué)活性鑒定　據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6],VIP能抑制M 經(jīng)LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)觀察了COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染M 經(jīng)LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)pcDNA3.1-VIP轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞上清能顯著抑制M 經(jīng)LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生,且呈劑量依賴性,與對(duì)照組相比P<0.01,表明該重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物具有生物學(xué)活性;VIP的中和抗體能中和此等抑制效應(yīng)(圖5)。圖4　表達(dá)產(chǎn)物的Westorn blot分析Fig.4　Westorn blot analysis of expressed product1: Supernatant of cells transfected withpcDNA3.1-VIP;2:Lysate of cells transfected withpcDNA3. 1-VIP; 3, 4: Supernatant and lysate ofcells transfected with pcDNA3.13　討　論由于VIP神經(jīng)肽基因的復(fù)雜性和表達(dá)的多樣性,到目前為止

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本文編號(hào)：2733200