【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)可引起急、慢性病毒性肝炎，導致肝纖維化(LC)，甚至肝細胞癌(HCC)。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)蛋白由631個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為70KDa，在HCV感染的慢性化、致纖維化、致癌作用中非常重要。 為研究HCV NS3蛋白的結(jié)合蛋白，我們用酵母雙雜交技術篩選表達型cNDA白細胞文庫中與丙型肝炎病毒NS3蛋白結(jié)合蛋白的基因。首先用多聚酶鏈反應(PCR)法擴增NS3基因，連接入酵母表達載體pGBKT-7中構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細胞AH109并在其內(nèi)表達，然后與轉(zhuǎn)化了人白細胞文庫質(zhì)粒的酵母細胞Y187進行配合，在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上進行雙重篩選陽性菌落，增菌后提出質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(DH5α)，提出質(zhì)粒并測序，進行生物信息學分析。結(jié)果成功克隆出NS3基因并在酵母細胞中表達，配合后選出既能在四缺(SD／-Trp-Leu-Ade-His)培養(yǎng)基又能在鋪有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培養(yǎng)基上生長并變成藍色的真陽性菌落18個，其中4個真核細胞翻譯延伸因子2；2個免疫球蛋白λ輕鏈；1個肌動蛋白β；1個鐵蛋白輕多肽；1個(絲裂原)活化蛋白激酶3；2個肌球蛋白因子1；1個白細胞介素2受體β；1 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 個富含精氨酸/絲氨酸剪切因子6:1個組織蛋白酶S;1個2’一5’- 寡腺甘酸合成酶類似物:1個缺失精子缺乏相關蛋白2;1個CNNZ; 1個新基因。上述結(jié)果表明已成功克隆出HCV NS3的結(jié)合蛋白，為 進一步研究HCV的作用提供了新線索。 為了探索HCV NS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我 們應用微矩陣(microarray)技術對于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的肝母細胞 瘤細胞系HepGZ進行分析。首先根據(jù)HCv一H病毒株序列設計、合 成序列特異性的引物。以含有全長Hcv一H株。DNA的pBRTM一30n 質(zhì)粒DNA作為模板，進行多聚酶鏈反應(PCR)擴增，獲得的HCV NS3 編碼基因片段克隆到TA載體中進行核昔酸序列的測定，構(gòu)建真核 表達載體pcDNA3一NS3。然后以pcDNA3一NS3轉(zhuǎn)染肝母細胞瘤細胞系 HepGZ，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行表達譜基因芯片分析。 最后應用分子生物學技術，結(jié)合生物信息學技術 (bioinformaties)，克隆HCV Ns3反式激活作用的新的靶基因。 結(jié)果顯示構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3一NS3經(jīng)過限制性內(nèi)切酶作圖 分析和核昔酸序列分析證實正確無誤。應用分子克隆技術結(jié)合生 物信息學技術克隆獲得NS3反式激活的新型靶基因，命名為 NS3TP6。新基因的編碼基因序列全長為414個核昔酸(nt)，編碼 產(chǎn)物由138個氨基酸殘基(aa)組成，是一種典型的病毒基因組 編碼的具有反式激活作用的蛋白。研究還表明，微矩陣技術是分 析基因表達譜變化的有效的高通量技術。發(fā)現(xiàn)的HCV NS3反式激 活作用的新的靶基因，并成功克隆了其中的NS3TP6，為闡明HCV Ns3蛋白的反式激活作用及其機制，開辟了新的研究方向。 為研究NS 3TP6的結(jié)合蛋白，用酵母雙雜交技術篩選白細胞中 與Ns3TP6蛋白結(jié)合蛋白的基因。首先用多聚酶鏈反應(P CR)法 擴增HCV NS3TP6蛋白基因，連接入酵母表達載體pGBKT一7中構(gòu)建 誘餌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細胞AH109并在其內(nèi)表達，然后與轉(zhuǎn)化了人 白細胞文庫質(zhì)粒的酵母細胞Y187進行配合，在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 上進行雙重篩選陽性菌落，增菌后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，提 取質(zhì)粒并測序，進行生物信息學分析。結(jié)果成功克隆出Hcv NS3TP6 蛋白基因并在酵母細胞中表達，配合后選出在四缺 (SD產(chǎn)Trp一Leu一Ade一HIS)培養(yǎng)基和鋪有X一a一半乳糖(X一a一gal) 的四缺培養(yǎng)基上均能生長并變成藍色的真陽性菌落共7個，其中3 個人類白細胞CD14抗原，1個人類免疫球蛋白入輕鏈，3個人類 推定蛋白基因(AC 1 24014，AC097504，AC023785)。以上實驗成功 克隆出NS3TP6蛋白的結(jié)合蛋白，為進一步研究HCV的作用提供了 新線索。 為了進一步研究NS3TP6可能的分子生物學功能，我們應用基 因芯片技術，檢測丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)反式激活 基因NS3TP6的表達對肝母細胞瘤細胞HepGZ基因表達譜的影響。 以分子生物學技術構(gòu)建NS3TP6的真核表達載體 peDNA3.1。)一NS3TP6，以表達質(zhì)粒peDNA3.1卜)一NS3TP6轉(zhuǎn)染HepGZ 細胞，以空載體poDNA3.1。)為平行對照，制備轉(zhuǎn)染后的細胞裂解 液，提取瓜RNA。應用基因表達譜芯片技術對差異表達mRNA進行檢 測和分析。結(jié)果顯示，HepGZ細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染NS3TP6后，有7條基因 表達增強，38條基因表達降低。應用基因表達譜芯片成功篩選了 NS3TP6的反式調(diào)節(jié)基因，為進一步闡明NS3TP6的反式激活作用及 免疫調(diào)節(jié)機制提供了新的依據(jù)。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻】

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本文編號：2731886