【摘要】： 一、原代小鼠肝細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 目的：建立一種操作簡(jiǎn)單且成本較低的小鼠肝細(xì)胞的簡(jiǎn)易分離方法，以用于原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)的研究，并進(jìn)一步為生物型人工肝研制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：選用昆明小鼠作為肝細(xì)胞的供體，采用改良膠原酶消化法對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行原位灌注，并回收膠原酶溶液循環(huán)利用，分離獲取小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；用臺(tái)盼藍(lán)染色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞存活率，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。 結(jié)果：每只小鼠平均可獲取6.58×10~6個(gè)肝細(xì)胞，平均存活率為64.1％。用含10％新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，12h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，48h伸出偽足，呈現(xiàn)典型的上皮樣細(xì)胞的外形形態(tài)，胞漿內(nèi)有空泡和脂滴，可以見(jiàn)到雙核細(xì)胞。相鄰細(xì)胞伸長(zhǎng)的偽足相互連接。在普通培養(yǎng)液中的肝細(xì)胞生存時(shí)間可達(dá)5～7d，之后細(xì)胞回縮，體積變小，逐漸死亡并且從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來(lái)，或者出現(xiàn)其他肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的現(xiàn)象。 結(jié)論：膠原酶原位灌注法可以用于分離原代小鼠肝細(xì)胞，并且分離獲得的肝細(xì)胞存活數(shù)目以及細(xì)胞活性均能夠滿足實(shí)驗(yàn)觀察的需要。 二、營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)短期單層培養(yǎng)的原代小鼠肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué) 中文摘要 影響。 目的：本研究在普通培養(yǎng)液中添加轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島 素、煙酷胺、p－琉基乙醇和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，觀察這些 營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)原代短期培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的影響， 旨在探討一種適用于原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方案。 方法：用膠原酶消化法獲取原代小鼠肝細(xì)胞，在兩種 不同的培養(yǎng)液中進(jìn)行短期單層培養(yǎng)，一種是含 10％新生牛 血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，簡(jiǎn)稱(chēng)為普通培養(yǎng)液。一種是在 RPMI 1640培養(yǎng)液中加入了 5 11 iml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5 P g／ml牛 胰島素、10nM煙酚胺、smM卜琉基乙醇，40 11 g／ml促肝 細(xì)胞生長(zhǎng)因子，簡(jiǎn)稱(chēng)為肝細(xì)胞培養(yǎng)液。利用倒置相差顯微 鏡來(lái)觀察并攝像記錄短期培養(yǎng)兩種不同的培養(yǎng)液中的小鼠 原代肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的變化。 結(jié)果：小鼠肝細(xì)胞在接種 12h后開(kāi)始出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象。 肝細(xì)胞培養(yǎng)液組貼壁的肝細(xì)胞數(shù)目明顯多于普通培養(yǎng)液 組，但此時(shí)兩組培養(yǎng)液中的小鼠肝細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的差異 并不顯著。接種24h后，兩組培養(yǎng)液中的肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué) 差異開(kāi)始出現(xiàn)，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，差異逐漸顯著。 普通培養(yǎng)液組的肝細(xì)胞伸出的偽足數(shù)目較少，細(xì)胞多呈三 角形或梭形，細(xì)胞胞體較小，透光度差，且死細(xì)胞較多， 高倍鏡下觀察細(xì)胞胞漿內(nèi)有粗大的顆粒狀物質(zhì)，并且有大 量的空泡，細(xì)胞呈現(xiàn)代謝不良的狀態(tài)。培養(yǎng)5～7d后，貼壁 細(xì)胞出現(xiàn)回縮變形，胞核變得模糊，細(xì)胞逐漸趨于死亡。 而肝細(xì)胞培養(yǎng)液組在低倍鏡下觀察，培養(yǎng)瓶的背景干猙， 死細(xì)胞較少，貼壁細(xì)胞伸出多個(gè)偽足，呈多邊形。相鄰細(xì) 胞連接成小片狀。高倍鏡下觀察胞漿內(nèi)容物豐富，顆粒細(xì) 2 中文摘要 小均勻，細(xì)胞透光度好，胞核圓而且透亮。肝細(xì)胞培養(yǎng)液 組的細(xì)胞的生活狀態(tài)可以雛持在 10叫 之內(nèi)基本不發(fā)生 變化。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論是普通培養(yǎng)液組還是肝 細(xì)胞培養(yǎng)液組的細(xì)胞均逐漸衰退死亡，或者出現(xiàn)其他的雜 質(zhì)細(xì)胞憂勢(shì)生長(zhǎng)現(xiàn)象。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中均未見(jiàn)到明顯的肝 細(xì)胞數(shù)目的增多。 結(jié)論：在培養(yǎng)液中添加轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島素、煙酚胺、 p－琉基乙醇以及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)原代小鼠肝 細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，并且可以改善肝細(xì)胞在體外的代謝，使 之維持良好的生活狀態(tài)并且延長(zhǎng)體外生存時(shí)間。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類(lèi)號(hào)】：R329.24

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王宇明;分離小鼠肝細(xì)胞的一種簡(jiǎn)易灌流法[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;1993年01期

2 朱薇,袁愛(ài)力,彭齊榮,賴(lài)卓勝,程天明;大鼠肝細(xì)胞的微載體黏附培養(yǎng)及其功能測(cè)定[J];中華器官移植雜志;2000年02期

3 孫綿方,蔡祝輝,施志清,馬風(fēng)竹;一種新型的生物人工肝—微囊肝細(xì)胞[J];中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào);1989年04期

本文編號(hào)：2714209