【摘要】： 目的： 原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)是肌肉收縮過程中的一種調(diào)節(jié)蛋白。本課題將基因重組的人平滑肌TM的同源體-β(hsmTM-β)表達于人冠狀動脈平滑肌細胞(CASMC)中，旨在探討TM對血管平滑肌細胞(VSMC)游走能力的影響，為探索平滑肌中原肌球蛋白的作用開辟新徑。 方法與結(jié)果： 一．基因重組hsmTM-β 采用套式PCR技術(shù)，從人主動脈cDNA文庫中擴增hsmTM-β的cDNA目的基因片段，用dGTP和T4 DNA聚合酶修飾；在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLIB基礎(chǔ)上正向插入AS-RI-Nru片段構(gòu)建載體pLIB-AS，用限制性內(nèi)切酶NruⅠ和EcoRI消化。目的基因和載體經(jīng)酚氯仿抽提，鹽乙醇沉淀純化后，用GENECLEAN Turbo核酸純化試劑盒從瓊脂糖膠中提純DNA，最后在DNA連接酶作用下，將hsmTM-β的cDNA反插入pLIB-AS中，獲得重組質(zhì)粒pLIB-AS-hsmTM-β。用熱休克法將重組DNA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌XL10-Gold中，重組質(zhì)粒按質(zhì)粒的小規(guī)模制備的堿裂解法提取和純化后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI驗證其全長，用PCR方法驗證其插入片段。結(jié)果顯示用反插入法可以實現(xiàn)hsmTM-β的基因重組。借助DNA SIS軟件分析人平滑肌TM和雞平滑肌TM的cDNA核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)二者同源性達84.7％。 二．hsmTM-β重組體的轉(zhuǎn)染和表達 參照逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的轉(zhuǎn)染和表達使用手冊，在DMEM和SmBM細胞培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)人胚腎細胞(AmphoPack-293)和人冠狀動脈平滑肌細胞(CASMC)至第三代，用CalPhos~(TM)哺乳類轉(zhuǎn)染試劑盒，將hsmTM-β重組質(zhì)粒pLIB-AS-hsmTM-β和含有增強綠色熒光蛋白(EGFP)cDNA的重組質(zhì)粒pLIB-EGFP分別轉(zhuǎn)染進 AnlphoPack一293中，產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒，然后感染CAsMC使基因表達。用chariot 蛋白轉(zhuǎn)染試劑盒將雞胃平滑肌原肌球蛋白(gTM)轉(zhuǎn)染進hsmTM一p/AS反義表達組 細胞中。蛋白表達用Westem Blot法檢測。 三.WestemBlot分析 從CASMC中獲取胞質(zhì)蛋白，經(jīng)12.5%SDS一AGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PDVF 膜上，用Westem blot法分析TM表達。PDV下膜用5%脫脂奶粉封閉液過夜后， 以兔抗原肌球蛋白多克隆抗體為一抗(l:1000)，抗兔免疫球蛋白抗體為二抗 (1: 5000)，結(jié)果顯示以純gTM為標準，與對照組和EGFP表達組相比，基因重組后 的hsmTM一p表達敲除。在hamTM一p/AS反義表達組細胞補充了gTM后表達平滑 肌原肌球蛋白(s mTM)，并隨gTM蛋白轉(zhuǎn)染量增多smTM表達增多。 四.VSMC游走測定 用Boyden’5 Ch田刀ber方法測定vSMC的游走，聚碳酸鹽濾過膜使用前以 0.01%I型膠原包被。培養(yǎng)的CASMC細胞以2 xl護/ml的密度經(jīng)胰蛋白酶消化后懸 于游走細胞培養(yǎng)液DMEM(含0.4%BSA)中。于Ch田刀ber的上室加感染不同質(zhì)粒的 CASMC;下室加含有PDGF一BB和不含有PDGF一BB游走細胞培養(yǎng)液。將Chamber 移至二氧化碳孵箱中，37oC孵育5小時。隨機選取四個400X高倍視野(4H衛(wèi)F)內(nèi) 游走細胞平均數(shù)評估細胞游走能力。 在PDGF一BB趨化劑刺激下，與對照組和EGFP表達組相比，單純hsmTM一p/AS 反義表達組細胞游走能力明顯增強(P005)。細胞的隨機游走能力在hemTM一p基 因敲除時同樣增強(P0.05)。在hsmTM一側(cè)AS反義表達組細胞補充gTM之后， hsmTM一p基因敲除對細胞游走的刺激作用消失口0.05)。 結(jié)論 人平滑肌TM一p和雞胃平滑肌TM一p的cDNA核昔酸序列的同源性達84.7%。 反插入法可實現(xiàn)hsmTM一p的基因重組，westem blot證實hsmTM基因敲除。 Boyden’s Chamber法測定平滑肌細胞游走，在PDGF一BB趨化劑下和細胞隨機游走 下hsmTM一p基因敲除后CASMC的游走能力均增強。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R337
【圖文】：

pLIB一AS經(jīng)Eco砒消化產(chǎn)生117bp和47bp兩個片段和164bP的未消化片斷。若AS一班一Nru片段是反向插入pLIB中，將產(chǎn)生137bp和27bp兩個片段，若AS一RI~Nru片段是正向插入pLIB中，產(chǎn)生的片斷應與pLIB一AS的情況一致。如圖1.4所示可見，樣本2是篩選出的正向插入pLIB中的所要構(gòu)建的pLIB一AS。PLIBpL田M一AS12345;::。爭…，5.skb4.7kb嚼.留祥:嶺州瓤圖1.5示hsmTM一p重組體經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcO人了切割在0.7%瓊脂糖電泳上的結(jié)果。pLIB一s是對照，樣本有10個。M是IKb的標準分子量。

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【引證文獻】

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1 烏云娜;莎麗娜;格日勒圖;;高壓處理對牛骨骼肌原肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J];食品工業(yè)科技;2012年03期

本文編號：2713260