【摘要】： 研究背景和目的 糖尿病腎病(DN)是導(dǎo)致終末期腎病的主導(dǎo)因素，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。在高血糖條件下，腎小球系膜細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分合成和分解代謝的紊亂直接導(dǎo)致了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明系膜自分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的活性介導(dǎo)了高血糖對腎臟的作用，而且TGF-β是人類和實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎小球硬化發(fā)展的主要決定因素。在高糖條件下下調(diào)TGF-β信號的治療途徑為我們提供了一個(gè)抑制DN發(fā)生、發(fā)展的策略。 蛋白聚糖Ⅱ，又稱decorin(DCN)是一個(gè)37KD，分泌性蛋白聚糖，含有一個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列的核心蛋白和一條糖胺聚糖鏈。DCN的作用包括了基本生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，比如基質(zhì)組裝，纖粘蛋白和血小板反應(yīng)素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)。而DCN另一個(gè)更重要的作用就是調(diào)節(jié)促細(xì)胞增殖及組織纖維化過程中的關(guān)鍵因子—TGF-β的活性。有證據(jù)說明DCN通過其核心蛋白與TGF-β1結(jié)合可以直接中和其活性。 為更好地揭示在高血糖環(huán)境下，DCN對TGF-β活性、細(xì)胞增殖及組織纖維化的抑制作用，并探討利用DCN基因轉(zhuǎn)染防治DN的可能性，本實(shí)驗(yàn)將通過從大鼠 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 腎組織中直接擴(kuò)增出DCN基因序列并構(gòu)建大鼠DCN重組腺病毒載體，為研究高 血糖時(shí)DCN對TGF一p的調(diào)節(jié)作用及DCN對糖尿病腎病治療的可能性奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法 成年雄性SD大鼠1只，體重2009，麻醉后迅速取出左側(cè)腎臟，去包膜。 從腎皮質(zhì)中用經(jīng)典方法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA后，用高保真聚合酶擴(kuò) 增出DCN序列。 將DCN的PeR產(chǎn)物和AdEasy系統(tǒng)中的穿梭載體pshuttle一CMV(pSC)質(zhì) 粒用Bgln和Hindin雙酶切后利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 至DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育過夜。挑取克隆，擴(kuò) 尹 增，抽提質(zhì)粒并經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定。將正確質(zhì)粒用Pmel酶切線性化，然 后用電轉(zhuǎn)化的方法將穿梭載體轉(zhuǎn)入BJS 1 83~AD一1感受態(tài)細(xì)菌(包含腺病毒骨架 質(zhì)粒pAdEasy一l)中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育過夜。挑取克隆，擴(kuò)增， 抽提質(zhì)粒稱為AD一DCN質(zhì)粒并經(jīng)PCR、酶切鑒定。同時(shí)構(gòu)建對照腺病毒載體質(zhì) 粒AD一LacZ，只需電轉(zhuǎn)化步驟。 擴(kuò)增經(jīng)鑒定正確的腺病毒載體質(zhì)粒，用Pacl酶切純化后，應(yīng)用MBS轉(zhuǎn)染試 劑盒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入50%一70%融合的AD293細(xì)胞中。當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)，收 獲細(xì)胞及培養(yǎng)上清，一70℃一37℃反復(fù)凍融3次，劇烈振蕩后離心收集上清，一70 ℃?zhèn)溆�。用原代病毒上清繼續(xù)感染AD293細(xì)胞，以形成第二代病毒。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.獲得SD大鼠腎組織的DCN片段 從成年SD大鼠腎臟皮質(zhì)中抽提出總RNA，RNA電泳顯示3個(gè)條帶，證明 RNA抽提完整。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后用高保真的聚合酶擴(kuò)增出DCN序列， 1%瓊脂糖凝膠電泳顯示片段在1100飾左右。 2.構(gòu)建成功AD一DCN質(zhì)粒與AD一LacZ對照質(zhì)粒及兩者的鑒定結(jié)果 雙酶切后的DCN片度和PSC進(jìn)行連接，獲得PSC一DCN，載體引物PCR、 雙酶切后電泳顯示有1100左右的片段條帶。測序結(jié)果表明從ATG順數(shù)除第117 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 位堿基出現(xiàn)突變，由原來的c突變?yōu)閠外，其他堿基不變。但此突變沒有改變翻 譯后的蛋白序列。PSC一DCN、PSC一LacZ電轉(zhuǎn)化入BJS 183.AD一1細(xì)菌中后獲得 AD一DCN和AD一Lacz質(zhì)粒。PcR、酶切后電泳鑒定有1 100bp左右的片段條帶。 3.重組腺病毒質(zhì)粒在AD293細(xì)胞中包裝及第二代病毒感染結(jié)果 腺病毒質(zhì)粒DNA，用MBS轉(zhuǎn)染試劑盒將其轉(zhuǎn)入AD293細(xì)胞中，至細(xì)胞培 養(yǎng)第13天，90%的AD293細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)并收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清。一70 ℃~37℃反復(fù)凍融、振蕩、離心后取上清感染AD一293細(xì)胞。至第5天幾乎所有 細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，證明包裝病毒為有活性的腺病毒。 結(jié)論 1.成功地從大鼠腎皮質(zhì)中擴(kuò)增出DCN基因序列并鑒定正確。 2.構(gòu)建了大鼠DCN的重組腺病毒載體質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切鑒定為正確克隆。 3.在AD293細(xì)胞中成功包裝出活性DCN腺病毒載體，為研究DCN的生物學(xué)特 性并為糖尿病腎病的基因治療奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 王桂琴,郭彩虹,孔憲濤,仲人前,李莉,張玲珍,劉濤,王紅蓓;核心蛋白聚糖對肝細(xì)胞和肝星形細(xì)胞體外增殖的影響[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年08期

2 阮昱,李紅,鄭芬萍,丁偉;吡格列酮對糖尿病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長因子β_1及Ⅳ型膠原表達(dá)的作用[J];中華糖尿病雜志;2004年05期

3 謝琳,賀翔鴿;轉(zhuǎn)化生長因子-β抑制劑Decorin抗眼結(jié)膜濾過泡瘢痕形成的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華創(chuàng)傷雜志;2003年02期

4 李紅,鄭芬萍,阮昱,李成江;吡格列酮對糖尿病大鼠腎皮質(zhì)TGF-β_1基因表達(dá)的抑制作用[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2003年03期

5 李紅,鄭芬萍,張哲;糖尿病大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)與腎皮質(zhì)中TGF-β_1mRNA水平的相關(guān)性研究[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年01期

6 張晉紅,李紅,趙曉霞,葉迅,丁偉;糖尿病大鼠腎臟蛋白聚糖Ⅱ和轉(zhuǎn)化生長因子-β_1mRNA的動(dòng)態(tài)變化[J];浙江醫(yī)學(xué);2004年12期

本文編號：2712993