本文關(guān)鍵詞：假結(jié)核耶爾森氏菌中rpoS基因的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：RpoS,又叫σS因子,是rpoS基因的編碼產(chǎn)物。RpoS作為穩(wěn)定期的σ因子和壓力應(yīng)答過程中的主要調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)控細菌體內(nèi)大量基因的表達,并且這些基因主要是與抗環(huán)境脅迫相關(guān)的基因。然而,在不同細菌中RpoS的功能似乎存在一定差別。例如,在大腸桿菌(Escherichia coli)中,RpoS對于細菌鞭毛的形成具有重要的調(diào)節(jié)作用。而在遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)中,RpoS對生物膜的形成具有一定的影響。在抵御外界環(huán)境脅迫的過程中,細菌VI型分泌系統(tǒng)、鞭毛及生物膜等可作為細菌的壓力應(yīng)答機制,對細菌起到保護作用。且有報道指出,生物膜是導致病原菌突破宿主細胞防御機制并引發(fā)感染的重要原因。本研究中假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)屬于耶爾森氏菌屬,是一種革蘭氏陰性腸道致病菌,為人畜共患菌種。作為一種病原菌,其首先要克服的就是宿主細胞的防御機制,之后才能發(fā)揮致病功能。然而目前為止,假結(jié)核耶爾森氏菌的致病機制尚未完全闡明�；谝陨涎芯勘尘�,本研究構(gòu)建了rpoS基因突變株及互補菌株,檢測了假結(jié)核耶爾森氏菌中rpoS基因的生理功能,包括在多種環(huán)境脅迫中的作用,對T6SS表達的調(diào)控,對鞭毛的調(diào)節(jié)作用以及對生物膜形成的影響。研究結(jié)果顯示,在細菌對環(huán)境的適應(yīng)方面,RpoS具有重要的調(diào)節(jié)作用。具體結(jié)果為:(1)通過構(gòu)建假結(jié)核耶爾森氏菌rpoS基因突變株與互補菌株,研究在1.5mM H2O2、pH4.0、0.5M NaCl和42℃脅迫條件下RpoS的功能。發(fā)現(xiàn)在這四種脅迫條件下,rpoS基因突變株的存活率較野生型菌株明顯降低。說明在假結(jié)核耶爾森氏菌中,RpoS在抵抗多種環(huán)境壓力中均具有重要的作用。(2)利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)手段檢測rpoS基因突變體中9種已知的壓力應(yīng)答相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示,除gadA基因外,其余8種基因的轉(zhuǎn)錄均受到RpoS的正調(diào)節(jié)。該結(jié)果進一步說明RpoS可能是通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)一些壓力應(yīng)答相關(guān)基因的表達而在細菌抗脅迫中發(fā)揮功能的。(3)通過β-半乳糖苷酶活性測定實驗,發(fā)現(xiàn)在rpoS基因突變體中第四套VI型分泌系統(tǒng)(T6SS4)的啟動子活性明顯降低。且qRT-PCR結(jié)果顯示,rpoS基因缺失將導致T6SS4的關(guān)鍵組分clpV4,hcp4,vgrG4基因的轉(zhuǎn)錄水平降低。凝膠遷移阻滯實驗結(jié)果進一步證實,RpoS對于T6SS4的調(diào)控是直接的。(4)對細菌的泳動情況進行觀察發(fā)現(xiàn),RpoS對細菌的運動具有正調(diào)節(jié)作用,并且β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果進一步說明RpoS能夠激活鞭毛一級調(diào)控基因flhDC的表達。(5)對線蟲體表生物膜形成的情況進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示RpoS對于生物膜的形成具有正調(diào)節(jié)作用。(6)通過對胞外多糖含量的測定及對多糖合成基因hmsHFRS的啟動子活性進行測定發(fā)現(xiàn),RpoS能夠控制胞外多糖的合成,進而影響假結(jié)核耶爾森氏菌生物膜的形成。
【關(guān)鍵詞】：假結(jié)核耶爾森氏菌 rpoS基因 細菌VI型分泌系統(tǒng) 生物膜 鞭毛
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 文獻綜述12-23
• 1.1 rpoS基因概述12-15
• 1.1.1 RNA聚合酶 σ 因子簡介12
• 1.1.2 σS（RpoS）的表達調(diào)控12-13
• 1.1.3 σS（RpoS）識別的啟動子序列13-14
• 1.1.4 rpoS基因的功能14-15
• 1.2 細菌VI型分泌系統(tǒng)概述15-17
• 1.2.1 細菌分泌系統(tǒng)簡介15-16
• 1.2.2 細菌VI型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)16-17
• 1.2.3 細菌VI型分泌系統(tǒng)的功能17
• 1.3 細菌的鞭毛系統(tǒng)17-19
• 1.3.1 鞭毛的結(jié)構(gòu)17-18
• 1.3.2 鞭毛的功能18-19
• 1.3.3 鞭毛基因的表達調(diào)控19
• 1.4 細菌生物膜簡介19-21
• 1.4.1 生物膜的形成機制與組成成分20-21
• 1.4.2 生物膜的調(diào)控機制21
• 1.5 假結(jié)核耶爾森氏菌概述21-22
• 1.6 本研究目的意義22-23
• 第二章 材料與方法23-31
• 2.1 材料23
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒23
• 2.1.2 試驗試劑和培養(yǎng)基23
• 2.2 方法23-31
• 2.2.1 原核表達質(zhì)粒pET28a-rpoS和互補質(zhì)粒pKT100-rpoS的構(gòu)建23-25
• 2.2.2 突變體的制備25
• 2.2.3 氯化銣法制備感受態(tài)25-26
• 2.2.4 細菌生長曲線的測定26
• 2.2.5 細菌存活率的測定26
• 2.2.6 重組蛋白原核表達和純化26-27
• 2.2.7 lacZ報告基因的融合及 β-半乳糖苷酶活性測定27
• 2.2.8 凝膠遷移阻滯實驗（EMSA）27-28
• 2.2.9 實時熒光定量PCR檢測脅迫相關(guān)基因的表達28-29
• 2.2.10細菌運動性的檢測29
• 2.2.11生物膜形成能力的檢測29
• 2.2.12胞外多糖的定量測定29-31
• 第三章 試驗結(jié)果31-43
• 3.1 △rpoS突變體的構(gòu)建31-33
• 3.1.1 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建原理31
• 3.1.2 重組質(zhì)粒pDM4-△rpoS的構(gòu)建31-32
• 3.1.3 rpoS基因突變體的篩選32-33
• 3.2 RpoS對細菌生長狀態(tài)的影響33
• 3.3 假結(jié)核耶爾森氏菌中RpoS抗脅迫功能的研究33-36
• 3.3.1 RpoS抗氧化脅迫功能的研究34
• 3.3.2 RpoS抗酸脅迫功能的研究34-35
• 3.3.3 RpoS抗?jié)B透壓脅迫功能的檢測35
• 3.3.4 RpoS抗熱脅迫功能的研究35-36
• 3.4 RpoS對脅迫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用36
• 3.5 RpoS對VI型分泌系統(tǒng)的調(diào)控作用36-39
• 3.5.1 RpoS對T6SS4的調(diào)節(jié)作用36-37
• 3.5.2 RpoS與T6SS4啟動子結(jié)合的檢測37-39
• 3.6 rpoS基因與細菌運動性的關(guān)系39
• 3.7 rpoS基因在生物膜形成方面的作用39-43
• 3.7.1 線蟲表面生物膜形成情況的觀察39-40
• 3.7.2 生物膜形成嚴重程度的統(tǒng)計40-41
• 3.7.3 RpoS對胞外多糖合成的影響41-43
• 第四章 分析與討論43-45
• 第五章 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-52
• 附錄52-56
• 致謝56-57
• 作者簡介57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王淑嫻;魏鑒騰;李天保;楊秀生;;細菌中RpoS蛋白的表達調(diào)控及其功能的研究進展[J];生物技術(shù)通報;2011年10期

  本文關(guān)鍵詞：假結(jié)核耶爾森氏菌中rpoS基因的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：267167