【摘要】：研制開發(fā)有效的新型抗結核疫苗，是當前結核病研究的主要目標。樹突狀細胞(DC)表面具有高密度的抗原遞呈分子和共刺激分子，能刺激初始型(na(?)ve)T細胞大量活化增殖。分枝桿菌Hsp65蛋白(熱休克蛋白)作為免疫優(yōu)勢抗原，能誘導和增強機體的抗結核免疫應答。我們用含有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的質(zhì)粒pEGFP-C1作為載體，用結核桿菌H37Rv株Hsp65 DNA為目的基因，構建重組質(zhì)粒pEGHsp65，以其轉(zhuǎn)染真核細胞，觀測蛋白表達。再將其導入DC中，制備新型抗結核的DC疫苗。 本研究根據(jù)結核分枝桿菌基因序列，設計一對PCR引物，以人型結核桿菌H_(37)Rv標準毒力株的總DNA為模板，經(jīng)過PCR循環(huán)擴增出Hsp65目的基因，將回收的PCR產(chǎn)物和載體pEGFP-C1用限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、EcoR Ⅰ雙酶切，再用T_4DNA連接酶連接，篩選得到的pEGHsp65陽性克隆經(jīng)酶切鑒定和DNA測序鑒定。用質(zhì)脂體方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入真核細胞(人宮頸癌細胞Hela細胞)，在共聚焦顯微鏡下觀測熒光表達強弱，，以調(diào)整優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。分別收集pEGHsp65、pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細胞，提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將其作為模板，加入Hsp65特異性引物進行PCR測定，并在PCR反應體系中補加內(nèi)參(β-actin)引物作為對照。無菌取小鼠骨髓細胞，加入細胞因子rmGM-CSF、rmIL-4培養(yǎng)，第8d收集細胞分別用光鏡和電鏡對誘導的DC進行形態(tài)學鑒定。將空載體質(zhì)粒和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入DC中，同時設立未轉(zhuǎn)染的細胞對照組。轉(zhuǎn)染48 h后在共聚焦顯微鏡下觀測熒光表達的強弱。用MTT比色法檢測DC疫苗刺激小鼠未致敏脾細胞的增殖。 結果顯示：重組質(zhì)粒pEGHsp65經(jīng)BglⅡ、EcoR Ⅰ雙酶切鑒定和DNA測序鑒定證實H_(37)Rv株Hsp65 DNA已插入重組表達載體pEGFP-C1中；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細胞，24 h即可觀察出轉(zhuǎn)染細胞有熒光蛋白的表達，48 h表達熒光蛋白的細胞數(shù)最多，培養(yǎng)72、96 h表達熒光蛋白的細胞數(shù)有所下降，強度減弱；RT-PCR檢測到重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染的細胞中有Hsp65 mRNA的表達;光鏡和電鏡對誘導的DC進行了形態(tài)學鑒定。 用MTT比色法檢測到DC疫苗能引起未致敏脾細胞增殖。 本課題初步完成了結核桿菌Hsp65與EGFP融合基因的構建及DC疫苗的制備。 為進一步觀察其治療結核病的效應奠定了基礎。
【圖文】：

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1AgarosegeleleetroPhoresisofPCRProduet

g/L瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察可見重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)兩條片段，一條大小為1.6kb(目的基因片段)，另一條大小為4.7kb(載體片段)，表明HsP65DNA己被正確插入到pEGFP一Cl中。(圖3)圖3重組質(zhì)粒pEGHsp65酶切圖譜Fig.3RestrietiveenZymeanalysisoftheeombinantPlasmidPEGHsP65
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 居巍,劉君炎,葉林柏;結核分枝桿菌pcHSP65真核表達載體的構建及序列測定[J];武漢大學學報(醫(yī)學版);2002年01期

本文編號：2665170