【摘要】：研究背景及目的 在多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF)和全身性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)發(fā)生中,來自循環(huán)血液病原體和/或其毒素以及由此而刺激產生的細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)和炎癥介質如脂多糖(LPS)等,均可導致血管內皮細胞(endothelial cells, ECs)通透性增高。近半個世紀的研究表明,可引起EC通透性升高的細胞因子和炎癥介質種類繁多,其中雖然有一些因子可直接損傷EC,但絕大多數是通過使EC肌動蛋白細胞骨架(actin cytoskeleton)發(fā)生改變,EC發(fā)生收縮和/或回縮,進而EC之間的間隙(gap)增大,導致內皮通透性增高。近年人們對EC肌動蛋白骨架的內在調節(jié)機制,以及病理情況下骨架蛋白重新分布(reorganization)的信號轉導機制及與細胞間隙變化的相關關系進行了一定的研究,認為Rho家族的GTP酶(Rho GTP ases)可能在細胞因子和炎癥介質所致的內皮通透性增高中起著主要的信號轉導作用。本文主要研究Rho家族中Rac1蛋白在血管EC形態(tài)和通透性變化中的作用,試圖闡明Rac1是否為調節(jié)EC肌動蛋白細胞骨架改變的重要信號分子,及其在炎癥介質介導的EC單層通透性增高中的信號轉導作用。 方法 (1) 根據Genebank hPBD mRNA序列,設計合成引物,從EC mRNA中克隆與Rac1和Cdc42相結合的人PAK1結合域(human WP=5 p21 binding domain, hPBD),將其插入GST融合蛋白表達質粒,轉化BL21宿主菌,表達與Rac1/Cdc42相結合的GST-hPBD融合蛋白,經親和層析純化后,用于pull down實驗,測定EC中活化的Rac1蛋白含量。(2)應用pull down分析檢測TNF-α和LPS刺激前后EC中Rac1蛋白的活化表達,應用Rhodamine-Phalloidin染色,熒光顯微鏡下觀察EC骨架重排。以HRP為示蹤劑測定刺激前后EC通透性的改變。通過上述工作探討EC Rac1活性的變化與細胞肌動蛋白骨架、細胞間隙和內皮單層通透性改變的關系。 結果 (1) DNA序列測定證實重組表達載體構建成功,經采用低溫誘導表達相對分子量為36KD的可溶性GST-hPBD融合蛋白,親和層析純化得到純度大于75%的GST-hPBD融合蛋白,并在pull-down實驗中檢測到活性Rac1蛋白的表達。(2) Western blot分析證實LPS作用1h,TNF-α作用2h,活化Rac1蛋白表達明顯增加;LPS作用2h,TNF-α作用4h,Rac1蛋白表達達到峰值。(3) 在相應濃度劑量下,TNF-α和LPS可明顯增加EC單層的通透性(p0.05),并呈時間依賴性。(4) 熒光倒置顯微鏡下,正常血管EC形態(tài)呈規(guī)則圓形、多角形,排列緊密、整齊,細胞與細胞間和細胞基底膜之間的粘附連接緊湊,基膜完整,無明顯的細胞間隙形成。TNF-α和LPS作用后細胞形態(tài)由圓形、多角形變成梭形,長寬比增大,細胞收縮,細胞間隙明顯增大,排列紊亂。(5) 正常對照組EC F-actin主要分布于細胞膜側,少量呈細絲狀無序地分布于胞漿,核周偶有應力纖維形成。LPS、TNF-α刺激后EC內F-actin的構像和分布發(fā)生變化,邊聚現象消失,胞漿內的F-actin明顯增多,出現大量的應力纖維,并呈極性分布,呈典型竹排樣結構�；罨疪ac1蛋白表達的增加與EC通透性增加、EC形態(tài)及細胞骨架變化在時相上具有相關性。 結論 hPBD原核表達載體的成功構建及融合蛋白的表達純化,為我們進一步探討Rho GTPases的活性改變提供了一個良好的實驗方法和實驗基礎。同時,細胞因子TNF-α和炎癥介質LPS刺激引起的細胞內皮通透性改變和細胞內骨架重排,與細胞內活化Rac1蛋白的 WP=6 增加在時相上密切相關,提示Rac1蛋白可能在肌動蛋白骨架及細胞間隙改變和內皮單層通透性的增高中起著信號轉導作用。
【圖文】：

圖 1 hPBD RT-PCR 產物電泳分析1: hPBD 產物; 2: DL2000 DNA marker組質粒的構建及鑒定R 擴增 hPBD 基因片段，擴增產物經 BamHⅠ和 E入 pGEX-2T 原核表達載體中連接并轉化大腸桿菌T-2T/hPBD 融合蛋白基因的重組質粒，構建過程如組菌提取質粒 DNA 雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳為 4.9Kb 和 270bp，與理論值相符，見圖 3。

圖 3 重組質粒的限制性內切酶分析1: 重組質粒 pGEX-2T/hPBD 經 BamH I/EcoR I 酶切;2: DL2000 DNA marker三．重組質粒 DNA 序列測定重組表達質粒測序結果如圖 4 所示，，重組質粒中所含的目的與 Genebank 的 hPBDcDNA 開放閱讀框架序列完全一致，證表達質粒構建正確。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻】

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1 陳莉芬;腫瘤壞死因子α在腎臟疾病中的研究進展[J];國外醫(yī)學.泌尿系統(tǒng)分冊;2001年04期

2 歐陽靜萍,王雄,Muller S,Stoltz JF;當歸對TNFα導致細胞骨架重排的逆轉作用[J];湖北醫(yī)科大學學報;2000年01期

3 隋廣智,王孔寶,沈若武;腫瘤壞死因子對培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞骨架的影響[J];解剖學雜志;2001年03期

4 姜勇;內毒素激活內皮細胞的信號機制的研究進展[J];中華醫(yī)學雜志;1999年01期

5 金惠銘,劉清行,張國平,張明,沙志一;TNFα對微血管內皮細胞的損傷作用及其分子機制(摘要)[J];中國微循環(huán);1999年04期

本文編號：2657390