【摘要】：背景與目的 陰道毛滴蟲系最早期的單細(xì)胞真核生物之一，沒有線粒體，，但有氫酶體，能量代謝方式主要為糖酵解，并能適應(yīng)在低氧環(huán)境下生長(zhǎng)。在自然條件下，毛滴蟲細(xì)胞是暴露于氧氣中的，盡管有人認(rèn)為低氧有利于毛滴蟲的生長(zhǎng)，但一般認(rèn)為氧氣是該細(xì)胞生長(zhǎng)的不利因素。例如：活性氧本身就可以滅活蟲體的活性酶，尤其是氫酶體的一些重要蛋白；氧代謝可以產(chǎn)生一些對(duì)細(xì)胞有害的過氧化氫、羥基等自由基。毛滴蟲主要依靠胞漿內(nèi)的NADH氧化酶將氧還原成水和NADPH氧化酶將氧還原為過氧化氫的作用來防止活性氧向氫酶體的滲透和損傷。由于毛滴蟲缺乏其它真核細(xì)胞所具有的CAT、GSH及GPx，那么它是如何清除由NADPH氧化酶及SOD所產(chǎn)生的過氧化氫等活性氧(ROS)的呢? 最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌、酵母及動(dòng)、植物中存在另外一種抗氧化酶過氧化物氧化還原酶(Prx)。Prx是一類硫氧還蛋白(Trx)依賴性酶，需要Trx作為還原劑，而氧化型的Trx則由硫氧還蛋白還原酶(TrxR)還原。Prx具有還原過氧化氫、烷基過氧化物等作用，因而可以防止ROS對(duì)細(xì)胞的損傷。Prx除了具有抗氧化作用外，也可以充當(dāng)?shù)诙攀�，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。對(duì)真核細(xì)胞中包括寄生蟲(錐蟲、蠕蟲、惡性瘧原蟲)在內(nèi)的Prx研究較多，但是缺少對(duì)無線粒體的真核細(xì)胞如溶組織內(nèi)阿米巴、賈第鞭毛蟲和陰道毛滴蟲Prx的功能認(rèn)識(shí)。本研究通過構(gòu)建陰 必決又夢(mèng)g夢(mèng)君礴公斗忿獷書尹奮丈 道毛滴蟲cDNA表達(dá)文庫，篩選分離出Trx和Prx等。DNA克 隆，并研究該系統(tǒng)在陰道毛滴蟲中的抗氧化作用及對(duì)細(xì)胞周期 的影響，為探索原生動(dòng)物衰老的基因調(diào)節(jié)通道奠定基礎(chǔ)。 材料和方法(1)提取陰道毛滴蟲的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定 RNA的濃度然后變性凝膠電泳鑒定RNA的純度。 (2)反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA一鏈，LD PCR合成和擴(kuò)增。DNA二 鏈，Sfil酶切純化，植入和包裝噬菌體，轉(zhuǎn)染細(xì)菌并進(jìn)行擴(kuò)增， 藍(lán)白斑測(cè)定文庫的滴度和重組率。 (3)挑取300個(gè)分界良好的噬菌白斑，轉(zhuǎn)導(dǎo)入E.coli BM25.8 菌中，堿裂解法提取質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增模板，根據(jù)克隆載體序 列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，電泳鑒定插入片段的大小，采用Sanger雙 脫氧鏈末端終止法對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序 列分析和同源性比較。 研究結(jié)果(1)按試劑盒提取總RNA 35時(shí)，紫外測(cè)定核酸含量 為653卜g/ml，A260/A280=1.98，用l%變性瓊脂糖凝膠電泳鑒 定，總RNA的1 85和2 85二條帶清晰，未見降解。 (2)取擴(kuò)增出的cDNA雙鏈與人胎盤細(xì)胞總RNA經(jīng)同步擴(kuò)增 后的雙鏈各5川進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，結(jié)果出現(xiàn)0，2一4kb的瀑 布狀拖帶，證明滴蟲的cDNA分子大小分布正常、完整;根據(jù) 平板上1:10，1:40，1:100不同稀釋度的噬菌斑數(shù)估計(jì)初始文庫 的包裝效率為6.78XI護(hù)pfu/ml，而文庫擴(kuò)增后的效率為1.68X 109 pfu/ml，經(jīng)藍(lán)、白斑測(cè)定文庫的重組率98%。 (3)插入片段大小在500一2300bp之間，平均為150obp，分離 出相關(guān)基因的eDNA克隆如Trx、Prx、Ras及SIRZ等。序列分 析發(fā)現(xiàn)Prx所編碼的膚鏈與衣滴蟲過氧化物氧化還原酶(Prxl 蛋白)及人的自然殺傷增強(qiáng)因子B分別有56%和61%的同源性; 除了兩個(gè)高度保守的半膚氨酸和蛋白激酶C磷酸化等作用基序 外，還有特有的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白信號(hào)位點(diǎn)及免疫球蛋白/主要組織 泌關(guān)又夢(mèng)硬夢(mèng)覺礴公斗君獷書鴻奮丈 相容性復(fù)合體蛋白信號(hào)位點(diǎn)。分離出兩個(gè)新的陰道毛滴蟲Trx 都有催化氧化還原反應(yīng)的高度保守序列WCGPC、疏水區(qū)以及參 與蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)等。 結(jié)論(1)成功構(gòu)建陰道毛滴蟲cDNA表達(dá)文庫，并從中分離 相關(guān)基因如Trx、Prx、Ras及SIRZ等eDNA克隆。 (2)Prx蛋白有56%以上可能位于胞漿，與典型的2一Cys Prx 亞家族有很高的同源性，是其中的一個(gè)新成員;分離出另外兩 個(gè)新的陰道毛滴蟲Trx基因。
【圖文】：

一18蟲中提取的總RNA:1RNA.RNAisolatedfrom刃.ind111maker，laneZ，t建第二鏈與人胎盤細(xì)胞總5川進(jìn)行瓊脂糖電泳分2)，證明滴蟲的cDNA分，卜丙bP

必決又矛硬夢(mèng)君礴必布忿對(duì)定:10，1:40，1:100等不同稀釋度平板上的噬的包裝效率為6.78x106pfu/ml，而文庫擴(kuò)109pfu/ml，經(jīng)藍(lán)、白斑測(cè)定文庫的重組率>G和x一gal的平板上挑取分界良好的噬菌白25.8菌中，提取DNA作為模板進(jìn)行PCR糖凝膠鑒定，結(jié)果片段大小在500一2300bpp(圖3)。用引物InsR和/或InsF作為測(cè)序脫氧鏈末端終止法對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，列分析和同源性比較。如
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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1 章家新,傅玉才,劉紅,鄭曉紅;陰道毛滴蟲硫氧還原蛋白過氧化物酶的cDNA克隆及序列分析(英文)[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2004年08期

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1 于瑩;利用羊草EST文庫克隆耐鹽堿相關(guān)基因[D];吉林大學(xué);2011年

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1 姜波;檉柳硫氧還蛋白過氧化物酶基因耐鹽功能分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2011年

2 王志堅(jiān);牙鲆自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子（NKEF）基因的克隆及其表達(dá)分析[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

3 任麗平;浉魚過氧化物還原酶Peroxiredoxin基因的分子克隆與表達(dá)分析[D];浙江海洋學(xué)院;2014年

4 孟繁薔;浉魚（Miichthys miiuy）自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子基因克隆及表達(dá)分析[D];浙江海洋學(xué)院;2014年

本文編號(hào)：2651392