【摘要】： 由蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)和蛋白酪氨酸激酶(PTKs)共同動態(tài)調節(jié)的可逆性蛋白酪氨酸磷酸化反應在調節(jié)細胞生長、分化、代謝、存活、細胞周期、細胞間相互聯(lián)系、細胞運動、基因轉錄、離子通道的活性、免疫應答等多種重要生命活動中具有重要作用。由于許多PTKs是癌基因和生長因子受體，因此已得到了廣泛而深入的研究，但PTPs的重要性直到最近十幾年才得到充分的認識。按照結構特點，PTPs被分為跨膜的受體型PTPs（R-PTPs）和可溶的胞漿型PTPs。前者又被分成七類，其中第II和III類R-PTPs的胞外區(qū)含免疫球蛋白樣結構域（Ig-like domain）和III型纖連蛋白樣結構域（FN-III repeats），與細胞粘附分子的胞外區(qū)具有相似性，表明其有可能參與調節(jié)細胞粘附。事實上，目前已證實PTPμ，PTPκ可通過其胞外區(qū)的同源性結合介導細胞粘附。 本課題研究的PCP-2是王紅陽教授等于1996年在胰腺癌細胞株中克隆并鑒定的一個R-PTPs家族的新成員，cDNA全長5581 bp，編碼一個含1430個氨基酸的具有磷酸酶活性的蛋白，與PTPμ，PTPκ具有較高的同源性，屬于IIB型R-PTPs。其胞內區(qū)含兩個磷酸酶結構域和一個相對較長的近膜區(qū)，該區(qū)與cadherins保守的胞內區(qū)具有一定的同源性，是cadherins與catenins相互作用所必需的，cadherins通過catenins的作用而與肌動蛋白細胞骨架作用，參與對細胞粘附的調節(jié)。越來越多的證據(jù)表明可逆的酪氨酸磷酸化是調節(jié)cadherins-catenins復合體的粘附功能的重要機制。到目前為止，對PCP-2的進一步研究的報道很少，關于PCP-2與catenins的相互作用以及PCP-2對細胞粘附遷移能力的影響還未見報道。 WP=5 本研究課題旨在通過應用Western Blot、Northern Blot、免疫共沉淀、定點突變和缺失突變、基因轉染等技術，研究PCP-2在真核細胞中的表達，比較PCP-2與PTPκ、PTPμ等同類分子在表達上的差別。然后從mRNA和蛋白表達水平研究PCP-2表達水平與細胞密度的關系，初步探討PCP-2對細胞接觸聚集的影響。繼之，采用基因轉染和免疫共沉淀技術研究PCP-2與β-catenin在細胞中的相互作用。明確二者可直接結合后，通過獲得PCP-2的EXT 、(C1C2 、(C2等一系列缺失突變體分析二者作用的結構基礎，通過構建PCP-2兩個磷酸酶結構域的定點突變體分析PCP-2對β-catenin的去磷酸化作用，進一步推理PCP-2與β-catenin相互作用的可能機制，為深入研究PCP-2對細胞粘附遷移能力的影響提供線索。最后采用Western Blot技術篩選一個PCP-2表達缺失的細胞系，直接觀察PCP-2轉染該細胞系后對細胞粘附遷移能力的影響。 本實驗室采用Western Blot 技術分析PCP-2在真核細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)在內源性表達PCP-2的WRL68細胞和外源性表達PCP-2的COS-7細胞中均只檢測到一個大小約為180 KDa的特異蛋白帶，無任何水解的蛋白片段，與PTPκ，PTPμ等同類分子具有顯著差異。 采用Northern Blot和Western Blot 分析PCP-2的表達水平與細胞密度的關系，發(fā)現(xiàn)PCP-2在mRNA和蛋白水平的表達均隨著WRL68細胞的密度增加而上升。100 %匯合率的WRL68細胞的PCP-2 mRNA表達水平是30 %匯合率細胞的3倍,而蛋白表達水平則上升至5.5倍，上升幅度明顯高于mRNA 水平。提示PCP-2的表達受轉錄水平和轉錄后水平共同調控，可能具有調節(jié)和穩(wěn)定細胞-細胞連接的作用。 通過表達并純化六組氨酸融合的β-catenin C-端融合蛋白，免疫新西蘭大白兔獲得抗β-catenin C-端的多克隆抗體。鑒定顯示：該抗體適用于Western Blot和免疫沉淀技術，效價約為1：500。為進一步研究PCP-2與β-catenin的相互作用提供了有效工具。運用基因轉染和免疫共沉淀技術研究PCP-2與β-catenin的相互作用，證實PCP-2與β-catenin可直接結合，而且經過將PCP-2、β-catenin和/或SrcY527F共轉染BHK-21細胞，或者用EGF刺激共轉染了PCP-2 和β-catenin的BHK-21細胞，發(fā)現(xiàn)PCP-2與β-catenin的結合與β-catenin的磷酸化狀態(tài)無關。通過限制性內切酶酶切或PCR技術獲得PCP-2的一系列缺失突變體 WP=6 PCP-2 EXT， PCP-2 ?C1C2和PCP-2 ?C2，采用基因轉染和免疫共沉淀技術，明確了PCP-2的近膜區(qū)是PCP-2與β-catenin相互作用所必需的。采用mega-primer方法獲得PCP-2兩個磷酸酶結構域的核心氨基酸Cys的定點突變體PCP-2 C1069S，PCP-2 C1364S，與β-catenin和/或SrcY527F共轉染BHK-21細胞，結果顯示PCP-2可使β-catenin去磷酸化，而且N-端近膜的磷酸酶結構域具有大部分或全部磷酸酶活性，C端的磷酸酶結構域幾乎沒有或者只有很少的磷酸酶活性。提示：β- catenin是PCP-2的一個底物。 用Western Blot篩選到PCP-2表達缺失的BHK-21細胞，采用基因轉染技術將PCP-2基因穩(wěn)定轉染至BHK-21后發(fā)現(xiàn)：PCP-2基因轉染抑制BHK-21細胞的遷移能力，選擇性促進BHK-21細胞對特異性粘附底物的粘附作用。 本研究結果表明：PCP-2在真核細胞中只表達一個蛋白，而無水解片段，PCP-2表達水平隨著細胞密度增加而上升。PCP-2通過其近膜區(qū)與β-catenin結合而相互作用，使β-catenin去磷酸化。生物學研究顯示PCP-2能抑制細胞遷移，促進細胞的粘附能力。
【圖文】：

.3.1. 構 建 PCP-2 胞 內 區(qū) 各 結 構 域 的 缺 失 突 變 體 取 抽 提K5RS-PCP-2 質粒和 pBSK 質粒各 4 μg，，用 XbaI 和 HindIII 雙酶切，回收酶得的大小約 5.58 kb (PCP-2)和 2.98 kb(雙酶切后完全線性化的 pBSK)的片段酶切所得的 PCP-2 cDNA 和 pBSK 片段用 T4 連接酶于 22 °C 連接 1 h。連接轉化宿主菌 XL1-Blue,如前所述鑒定出正確的 pBSK-PCP-2 克隆(以aI+HindIII 酶切觀察到 2.98 kb 和 5.58 kb 兩條帶為正確)。該質粒的限制性位點分布如圖 1 所示。

PCP-2點突變體相對位置示意圖
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：Q55

【共引文獻】

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本文編號：2643608