發(fā)布時間：2020-04-11 12:52

【摘要】：端粒酶維持線形染色體的端粒末端結構的完整，防止染色體的縮短及和其它染色體的融合。有資料表明超過85％的腫瘤細胞表達端粒酶活性，而在正常組織中很少表達。人類端粒酶主要包括3種成分：人端粒酶RNA成分(hTR)，人端粒酶相關蛋白(hTP1)，人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)。hTERT mRNA的表達水平與端粒酶活性正相關，hTERT只在端粒酶陽性的腫瘤細胞和永生化細胞中表達，正常組織中不表達。許多實驗證實了來源于hTERT的多肽可由MHC Ⅰ類分子加工遞呈，作為抗原激發(fā)腫瘤特異性CTL反應，可殺死不同組織來源的腫瘤細胞。hTERT是一種可表達于多種腫瘤組織中的腫瘤相關抗原，編碼hTERT的基因是有很好應用前景的腫瘤免疫治療的靶基因。 目的： 本課題擬構建hTERT基因真核重組質粒pcDNA3.1-hTERT及原核重組質粒pGEX-4T-1-hTERT，并觀察在BL21細菌中原核重組質粒的表達，為進一步探討以hTERT為靶點的腫瘤基因免疫治療提供實驗基礎。 方法： 一．重組質粒的構建及基因測序 1．真核重組質粒pcDNA3.1-hTERT的構建：從腫瘤組織中提取總RNA；用RT-PCR方法擴增出帶有Hind Ⅲ，BamH Ⅰ酶切位點的hTERT基因片段；hTERT基因片段與pGEM-T Easy克隆載體連接，將重組子轉化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中，用藍白篩選，PCR擴增，PvuⅡ酶切鑒定等方法篩選出陽性克隆。用Hind Ⅲ及BamH Ⅰ酶切pGEM-T Easy-hTERT質粒獲得目的片段，與Hind Ⅲ及BamH Ⅰ酶切處理過的pcDNA3.1載體連接，重組子轉化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中，用PCR擴增，PvuⅡ酶切鑒定等方法篩選出 鄭州大學碩士學位論文 hTERT重組質粒的構建及其表達 陽性克隆并測序。2.原核重組質粒pGEX一4T-1一hTERT的構建:用Rl’- pCR方法擴 增出帶有EooRI酶切位點的hTERT基因片段，hTERT基因片段與pGEM一T Easy 克隆載體連接，將重組子轉化入JM109感受態(tài)大腸桿菌中，用藍白篩選，PCR 擴增，Pvun酶切鑒定等方法篩選出陽性克隆。用EcoRI酶切pGEM一T Easy一hTERT質粒得到目的片段與用EcoRI酶切過的pGEX一4T-1質粒連接，重 組子轉化BLZI感受態(tài)細菌，PCR擴增篩選出陽性克隆�；驕y序并用Omiga 2.0 軟件比較分析重組質粒中hTERT基因片段與GenBank中公布的已知序列的同源 性。 二.原核重組表達質粒的表達鑒定IPTG誘導帶有pGEX一4T-1一hTERT質粒 的BL21細菌融合蛋白的表達，取不同時間的培養(yǎng)物進行SDS一PAGE電泳分析， 并進行薄層凝膠光密度掃描測定目的蛋白表達量，同時對表達產物進行 Westem一blot檢測。 結果: 1.成功構建了PcDNA3.1一hTERT真核重組質粒及pGEx一4T-1一hTERT原核 重組質粒。 2.經過測序表明，hTERT基因片段全長951帥，編碼由317個氨基酸殘基 組成、相對分子量為37KDa的蛋白質。hTERT基因與GenB歇正公布的相應基因 進行同源性比較，結果表明核普酸序列的同源性為98‘73%，其編碼產物的氨基 酸序列的同源性為99.68%。 3.對sDS一PAGE結果分析發(fā)現，含pGEx一 4T-1一hTERT質粒的BLZI細菌能 夠表達出63KDa的融合蛋白。薄層凝膠光密度掃描測定其表達水平最高為 28.4%，以IPTG誘導4小時表達量最高。 4.認七stom一blot檢測表明該融合蛋白可被hTERI，多抗識別。 結論: 1，序列分析結果證明了所選取的hTERT基因片段是保守區(qū)域，為以hTERT 為靶點的腫瘤免疫治療研究提供重要的前提。 2.成功構建了peDNA3 .1一hTERT真核重組質粒和pGEX一4T-1一hTERT原核 重組質粒。 3.誘導pGEx一4T-1一hTERT重組質粒，獲得分子量為63KDa的GsT-hTERT 鄭州大學碩士學位論文 hTERT重組質粒的構建及其表達 融合蛋白。用抗hTERT多抗對融合蛋白進行W七stem blot鑒定，，有明顯的抗原抗 體反應，證實融合蛋白中含有hTERT目的基因片段表達的相應抗原蛋白。 4.PcDNA3.1一hTERT真核重組質粒及pGEX一4T-1一hTERT原核重組質粒的成 功構建，為進一步探討以hTERT為靶點的腫瘤免疫基因治療研究提供了重要的 實驗依據。
【圖文】：

士學位論文hTERT重組質圖1pG陰seTEasy質粒(克隆載體)圖譜M一TEasy是為方便PCR產物克隆、藍白篩選重組體、體外轉設計的載體。它由以下部分組成:絲狀噬菌體復制起始con內單鏈DNA的合成;質粒在E.coli中的復制起始點(o(靦pr)用于原核細胞篩選;多克隆位點;多克隆位點兩側錄起始點，使插入的外源DNA每一條鏈都能在體外進行轉突出的T堿基，這一特點使載體和產物之間產生小的互補效果。

圖3pGE卜4T一1原核表達載體圖EX一4T一1原核表達載體:具有tac啟動子;lac操縱基因;lac工膚昔膚琉基轉移酶(GST)基因;原核細胞選擇標志采用內酞胺因(Ampr)。ED、丙烯酞胺、N’N一亞甲基雙丙烯酞胺;p一琉基乙醇(Sigm50(上海政翔化學試劑研究所);二氨聯(lián)苯胺(DAB)(Roche公困C膜X北京益利精細化學品有限公司);PVDFWeste(Bio一Rad公司);proteinmarker(TaKaRa公司)。(鼠抗hTERT多抗血清)，二抗(HRI，標記的兔抗鼠IgG)。和常用溶液的配制一
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2623616