【摘要】： 目的 構(gòu)建一個完整的中國人β-地中海貧血（簡稱β-地貧）突變基因標(biāo)準(zhǔn) 樣品庫。這個已知基因背景（DNA順序）的樣品庫可作為一種標(biāo)準(zhǔn)品用于 評價包括基因芯片在內(nèi)的檢測中國人β-地貧的診斷新技術(shù)的特異性和可 靠性。 方法 1、中國人β-地貧13種常見突變類型克隆基因庫的構(gòu)建：根據(jù)本實驗室 已保存的中國人β-地貧標(biāo)本，首先采用PCR技術(shù)直接從人基因組DNA 樣品中獲取目的基因—含某一突變的β-珠蛋白基因，然后運用經(jīng)典的基 因工程技術(shù)將其克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化的宿主菌為大腸桿菌 JM109。每個克隆重組子中插入的目的基因進行DNA測序以驗證基因 突變型。 2、16種中國人β-地貧稀少突變類型克隆基因庫的構(gòu)建：通過基于PCR 設(shè)計的人工致突變反應(yīng)體系從野生型樣品中制備含所需點突變的目的基 因，再運用經(jīng)典的基因工程技術(shù)將誘變得到的目的基因進行克隆并測序 鑒定。 3、兩種改進的大引物PCR定點誘變方法的建立 方法1：構(gòu)建一個含全長野生型β-珠蛋白基因的質(zhì)粒DNA模板，第 1輪PCR由中間的突變引物和正向外側(cè)引物合成大引物，在第2輪PCR 凝膠純化后的PCR產(chǎn)物—大引物全部加入反應(yīng)管同反向外側(cè)引物一起 合成全長誘變終產(chǎn)物。 方法2：在兩輪PCR中設(shè)計兩種不同的質(zhì)粒DNA模板，兩者分別 缺少正向或反向外側(cè)引物可結(jié)合的互補序列，這樣兩種質(zhì)粒DNA模板 不可能同時被兩條外側(cè)引物擴增而產(chǎn)生全長野生型目的基因序列。第1 輪PCR由正向外側(cè)引物和突變引物在質(zhì)粒1的指導(dǎo)下合成大引物，這 一產(chǎn)物無需凝膠純化而直接取小量（2～3μl)用于第2輪PCR反應(yīng)。第2 輪PCR的第1階段在質(zhì)粒2的指導(dǎo)下由大引物延伸合成全長突變終產(chǎn) 物，兩條外側(cè)引物則在第2階段指數(shù)擴增，所有終產(chǎn)物均含所需致突變 位點。 結(jié)果 成功地定點誘變了中國人卜地貧16種稀少突變類型，誘變的成 功率可達 100％。完整地構(gòu)建了含 29種中國人p－地貧突變基因的克隆 庫。 結(jié)論 本研究建立了兩種改進的、簡便易行的大引物PCR定點誘變方 法，此方法可用作研究基因的表達以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系 的基本技術(shù)。本研究的完成也為本實驗室保存珍貴的DNA樣品提供了 一套常規(guī)的技術(shù)方法。研究所得到的中國人卜地貧突變基因克隆庫在診 斷用中國人卜地中海貧血基因芯片的研制中為建立反應(yīng)體系發(fā)揮了重要 作用，并可作為將來基因芯片新藥報批的標(biāo)準(zhǔn)品。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R556.61;Q78

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2611962