【摘要】：背景與目的: 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)可引起慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等上消化道疾病,并與胃癌、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生有關�，F階段臨床治療Hp感染中存在患者依順性差、費用昂貴及日趨嚴重的細菌耐藥性等問題。大量實驗證明,Hp疫苗能有效地預防Hp感染。目前研究中的Hp疫苗基本都屬于預防性疫苗。然而,對Hp感染人群還需要進一步研制安全有效的治療性Hp疫苗。動物實驗研究發(fā)現,以Hp全菌抗原為基礎的疫苗對Hp感染有一定的治療效果。 因此,本研究對Hp滅活全菌治療性疫苗進行初步研究,摸索滅活全菌的制備,篩選佐劑、免疫劑量、免疫途徑及免疫周期,觀察免疫治療效果及對Hp再次感染的抵抗力,初步探索Hp治療性疫苗免疫清除機制。 實驗設計: 1. 疫苗抗原制備:通過對接種量和產量定量,優(yōu)化液體培養(yǎng)Hp條件,福爾馬林滅活Hp全菌并檢定其質量。 2. 佐劑選擇:分別以CT、LT、CpG為粘膜佐劑口服免疫,以弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑和CpG注射免疫Hp感染沙鼠模型,觀察治療效果。 3. 免疫劑量、免疫途徑、免疫周期的確定:用滅活Hp全菌加氫氧化鋁佐劑(以下簡稱“Hp治療性疫苗”)注射免疫Hp感染沙鼠模型,選擇最佳注射免疫途徑、免疫劑量、免疫周期。 4. Hp治療性疫苗免疫治療效果、免疫記憶性觀察:Hp治療性疫苗注射免疫Hp感染沙鼠模型,末次免疫后1月再次用同一菌株感染,觀察治療效果及抵抗再感染的作用。 5. 免疫清除機制探索:RT-PCR檢測疫苗免疫后沙鼠胃粘膜的INF-γ、IL-4及IL-12p40表達量的相對差異;Hp治療性疫苗用同樣方法免疫BALB/c小鼠,ELISA檢測不同時間Hp特異性血清IgG、IgA和唾液sIgA水平的變化。 研究結果: 1. 液體培養(yǎng)Hp接種菌量以106/ml為宜,培養(yǎng)27小時最佳;1:2000福爾馬林25℃下滅活1×109CFU/ml Hp全菌14小時,滅活完全,鏡下觀察其形態(tài)無變化,抗原性好, WP=9 4℃可保存12個月以上。 2. 滅活Hp全菌加氫氧化鋁佐劑注射對沙鼠胃內Hp清除率較高,達93.3%。 3. 抗原以1×108CFU菌量為宜;0、1、2、3周免疫周期效果好。 4. Hp治療性疫苗對沙鼠胃內Hp清除率達93.3%,對再次攻毒的保護率達90.0%。 5. 疫苗免疫后沙鼠胃粘膜INF-γ、IL-4及IL-12p40表達量均增加;BALB/c小鼠末次免疫后3周開始,特異性血清IgG、IgA和唾液sIgA水平均顯著升高。 結論: 本研究優(yōu)化了Hp培養(yǎng)及福爾馬林滅活條件,篩選了Hp治療性疫苗的佐劑和免疫方案。Hp治療性疫苗注射免疫Hp感染的沙鼠,能夠產生良好的免疫應答并能有效清除Hp感染,而且對Hp再次攻毒有很好的免疫保護作用。沙鼠胃粘膜INF-γ、IL-4及IL-12p40表達量的改變,提示該疫苗的作用機制是誘導Th1/Th2平衡型免疫應答,免疫后BALB/c小鼠特異性抗體顯示該疫苗誘導Hp特異性血清IgG、IgA和sIgA水平均升高。本試驗為研究Hp治療性疫苗提供了重要實驗依據。
【圖文】：

1：4000 福爾馬林滅活 16h 1：8000 福爾馬林滅活 16hHp inactivated with 1：4000 formalin by 16 hours Hp inactivated with 1：8000 formalin by 16 hours圖 3 不同福爾馬林濃度滅活 Hp16h 革蘭氏染色油鏡下觀察對比Fig 3 Observation results of Hp Inactivated with different formalin concentrations by 16 hours1 2 3 4 594KD67KD43KD30KD20.1KD14.4KDLane1: protein markerLane2: inactived Hp with 1：1000 formalinLane3: inactived Hp with 1：2000 formalinLane4: inactived Hp with 1：4000 formalinLane5: inactived Hp with 1：8000 formalin

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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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