發(fā)布時間：2020-03-21 13:05

【摘要】： 無毛小鼠(hairless mice)是一種不同于裸小鼠(nude mice)而皮膚和毛發(fā)結(jié)構(gòu)發(fā)生遺傳突變的小鼠新品系。國外已有多種無毛小鼠品系，而國內(nèi)有關(guān)無毛小鼠這方面的報道卻很少。1990年，河南省實驗動物中心在昆明種實驗小鼠繁殖群中，發(fā)現(xiàn)一株無毛突變小鼠。經(jīng)過10多年的研究，已建成一無毛小鼠的近交系，命名為豫醫(yī)無毛小鼠(Yuyi Hairless Mice，簡稱YYHL)。該種小鼠出生時被毛生長正常，2—3周開始脫毛，經(jīng)大約2周時間除胡須外其余被毛全部脫凈，并終生保持無毛狀態(tài)。該種小鼠生長過程中，除被毛的脫落外，頭部和體側(cè)皮膚也逐漸顯得松弛、出現(xiàn)皺褶，時值壯年(7-8月齡)已“老態(tài)龍鐘”；松弛的上瞼皮膚甚至遮蓋雙眼，致使行走覓食困難。該突變無毛小鼠自然壽命大約是10個月余，僅為正常昆明小鼠壽命的一半。其胸腺退化也早于野株小鼠、免疫力下降，特別是細(xì)胞免疫。根據(jù)孟德爾遺傳學(xué)原理，分析其遺傳圖譜，證實脫毛性狀是由于常染色體上單一隱性基因發(fā)生突變所致。為了進(jìn)一步研究造成無毛小鼠相應(yīng)表現(xiàn)型變異的遺傳學(xué)根源，本實驗擬檢測定位無毛基因，對豫醫(yī)無毛小鼠進(jìn)行深入的分子生物學(xué)研究。復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，根據(jù)GenBank存儲的類 鄭州大學(xué)2002年碩士畢業(yè)論文 原位PCR檢測定位豫醫(yī)無毛小鼠無毛基因 似的突變株無毛基因全序列設(shè)計引物。應(yīng)用原位PCR的方法，檢 測定位豫醫(yī)無毛小鼠胸腺、脾組織切片和骨髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞內(nèi) 的無毛基因。確定豫醫(yī)無毛小鼠與其他得到國際公認(rèn)的無毛小鼠， 如：rhlno mice，hairless mice等基因結(jié)構(gòu)萬面的同源性。 結(jié)果 1．石蠟組織切片上突變基因的獲得：利用基因文庫中的無毛 基因全序列設(shè)計一對引物，即引物 P；和 Py引物 5”端用生物素標(biāo) 記。應(yīng)用豫醫(yī)無毛小鼠的胸腺、脾做石蠟組織切片，正常昆明小 鼠的胸腺、脾的組織所做石蠟組織切片作為對照。應(yīng)用蛋白酶K 改變石蠟切片上組織的通透性，用多聚甲醛固定組織，乙醇水化。 熱啟動：在 PCR擴(kuò)增前，部分 PCR反應(yīng)混合液（不加 Taa DNA多 聚酶）94oC預(yù)熱 smin，然后再加入 Taq DNA多聚酶。每張玻片上 加4oUL＊＊R反應(yīng)液，蓋上蓋玻片，液體石蠟封片。于94℃熱板 上變性smin，50℃復(fù)性10min，72OC延伸10min；共進(jìn)行2 5個循 環(huán)。對照：正常昆明小鼠的石蠟切片；豫醫(yī)無毛小鼠石蠟組織切 片不加引物對照和不加 Taq DNA聚合酶的對照。反應(yīng)結(jié)束后三氯 甲烷，酶學(xué)方法檢測雜交信號，在顯微鏡觀察結(jié)果并記錄。確定 有雜交信號吸附在組織上。 2．染色體標(biāo)本的獲得：用戊巴比妥鈉麻醉豫醫(yī)無毛小鼠和正 常的昆明小鼠實驗群。腹部酒精消毒，置超凈臺中，取心臟血大 約 lml，用淋巴細(xì)胞分離液分離，PB S沖洗數(shù)次，以去除淋巴細(xì)胞 分離液。同時取小鼠脾臟，，邊研磨邊滴加 yMI 640，用淋巴細(xì)胞 分離液分離，PBS沖洗。心臟血和脾臟的淋巴細(xì)胞在RPMI 1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 72h，培養(yǎng)時在 RPMI 640培養(yǎng)液中添加刀豆蛋白 A， 2 鄭州大學(xué)2002年碩士畢業(yè)論文 原位P＊R檢測定位豫醫(yī)無毛小鼠無毛基因 培養(yǎng)至 70h時，向 yMI 640培養(yǎng)液中加秋水仙素，培養(yǎng)至 72h， 收集培養(yǎng)液離心，0刀SMKCI低滲50min，離心，甲醇／冰乙酸固定 3次，把固定好的淋巴細(xì)胞均勻平鋪與載玻片上（玻片用多聚賴氨 酸處理人 取幼齡的豫醫(yī)無毛小鼠和相當(dāng)月齡的正常昆明小鼠，腹 腔注射秋水仙素，作用4h后，將小鼠斷頸處死，分離股骨，用注 射器沖洗骨髓腔，離心收集骨髓細(xì)胞，0刀SMKCI低滲80而n， 離心，甲醇／冰乙酸固定。把固定好的淋巴細(xì)胞均勻平鋪與載玻片 上（玻片用多聚賴氨酸處理人 這樣就準(zhǔn)備好了處于分裂中期的染 色體涂片。 3．染色體G顯帶：將步驟2中制備好的淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的 染色體涂片，在室溫放置一星期后，用胰酶法顯示G分帶。染色 體涂片于37OC在胰酶中處理Zmin，PBS沖洗，Giemsa染色，觀察 條帶清晰度和分散情況，選擇比較好的涂片用甲醇／冰乙酸脫去 Giemsa的顏色，用于PCR反應(yīng)。 4．染色體涂片上突變基因的獲得：染色體涂片用多聚甲醛處理 后，選取染色體分散好的標(biāo)本。熱啟動：在PCR擴(kuò)增前，部分PCR 反應(yīng)混合液（不加 Taq DNA多聚酶）94oC預(yù)熱 5 min，然后再加入 Taq DNA多聚酶。每張玻片上加 40 uL PCR反應(yīng)液，蓋上蓋玻片， 液體石蠟封片。于94oC熱板上變性smin，50oC復(fù)性 10min，72oC 延伸 10min；共進(jìn)行 2 5個循環(huán)。對照組：正常昆明小鼠的染色體 涂片；豫醫(yī)無毛小鼠染色體涂片不加引物對照和不加 Taq DNA聚 合酶對照。三氯甲烷洗脫，酶免疫學(xué)檢測。顯微鏡下觀察延伸標(biāo) 記信號。雜交過的染色體標(biāo)本Gimsa染色。顯微鏡下觀察雜交信 號好。選擇染色體分布比較開的，染色體形狀比較清晰的視野記． 二號 鄭州大學(xué)2002年碩士畢業(yè)論文 原位PCR檢測定位豫醫(yī)無毛小鼠無毛基因 錄。 實驗結(jié)果為進(jìn)一步研究豫醫(yī)無毛小鼠的生物學(xué)特性、
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 章金濤,王純耀,康巧珍,楚樹敏,祝慶蕃,杜春燕,金樹興;突變無毛小鼠近交系的育成及特性[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2001年03期

2 陳林姣,繆穎,陳德海;原位PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J];生物工程進(jìn)展;2000年02期

3 鄭寧,余竹元,朱世能;一種新型直接原位PCR法[J];中華病理學(xué)雜志;1998年01期

4 倪斌,李輝,鄒永華,吳嵩齡;應(yīng)用引物原位標(biāo)記技術(shù)快速檢測X和18號染色體[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;1998年06期

本文編號：2593373