【摘要】：腫瘤壞死因子(TNF)是由3個(gè)分子量為17kDa亞單位組成的同源三聚體的可溶型蛋白質(zhì)，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。體內(nèi)還存在分子量為26kDa的膜結(jié)合形式的TNF。TNF不僅是具有多方面免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，而且通過刺激巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和介質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織的損傷。TNF的過量表達(dá)與感染性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤等多種疾病有關(guān)。在制定多種疾病生物學(xué)治療的策略中，TNF成為關(guān)鍵的靶位之一。 針對TNF的中和活性單克隆抗體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對內(nèi)毒素和細(xì)菌引起的病理改變有明顯的阻斷作用。但鼠源性單抗在人體使用時(shí)，對人體具有免疫原性，可引起免疫反應(yīng)，導(dǎo)致對抗體的清除，并引起免疫復(fù)合物介導(dǎo)的超敏反應(yīng)。為了解決上述問題，建立了對鼠源性抗體改造的多種方法，如構(gòu)建嵌合抗體或人源化抗體。在嵌合抗體構(gòu)建過程中，最為重要的是篩選具有良好親和力及中和活性的鼠源性親本抗體，克隆其輕鏈和重鏈可變區(qū)基因。然后將可變區(qū)基因與人抗體恒定區(qū)基因連接，構(gòu)建重組抗體基因。最后，將構(gòu)建好的鼠-人嵌合基因?qū)胝婧思?xì)胞中，表達(dá)嵌合抗體。 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論又 臨床上用抗TNF嵌合抗體治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和節(jié)段性腸炎取得 了良好的療效。美國FDA于1 998年和1 999年分別批準(zhǔn)了用抗TNF 嵌合抗體治療節(jié)段性腸炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。因此，篩選出高親 和力及中和活性的鼠源單克隆抗體，克隆出其輕、重鏈可變區(qū)基 因，對構(gòu)建高質(zhì)量的嵌合抗體具有重要的意義。 我室制備了一組抗人TNF單抗，根據(jù)其效價(jià)及其與天然TNF 的結(jié)合特性，從中選擇了三株雜交瘤細(xì)胞，分別命名為D2、E6和 F6，，按常規(guī)方法制備腹水。腹水經(jīng)硫酸按沉淀后，分別用陰離子 交換層析法和蛋白A親和層析法對其進(jìn)行了純化，抗體純度用 SDS一PAGE鑒定。D2、E6和F6三株單抗的純度分別達(dá)到91%、93% 和94%。高純度抗體是親和力和中和活性鑒定的重要保證。 親和力是治療用單抗的重要指標(biāo)之一。高親和力的單抗所需 劑量低，可大大降低治療成本，減輕過敏反應(yīng)。用間接EL工SA法 測定腹水和純化單抗的效價(jià)表明，三株單抗的效價(jià)較高，D2、E6 和F6腹水效價(jià)分別為lxlo一6、lxlo一7和lx10一7，純化抗體效價(jià) 分別為10ng/ml、2 ng/ml和2 ng/ml。 中和活性指單抗可阻斷TNF與其受體的結(jié)合，是治療用抗人 TNF單抗最為主要的參數(shù)。依據(jù)TNF參與炎性病理損傷的主要機(jī) 制，采用單抗抑制TNF誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡，單抗抑制T鄧上調(diào) ECV3O4細(xì)胞ICAMd的表達(dá)，以及單抗抑制TNF誘導(dǎo)NF一B的核 轉(zhuǎn)位等三個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，分別在誘導(dǎo)凋亡、勃附分子表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因 子活化和轉(zhuǎn)位等不同水平系統(tǒng)鑒定所選三株單抗的中和活性。結(jié) 果表明，三株單抗對TNF誘導(dǎo)的L929細(xì)胞凋亡的抑制作用有劑量 依賴關(guān)系，濃度為0.16、0.40和0.40件g/ml的DZ、E6和F6單 抗，可保護(hù)ZOU/ml TNF誘導(dǎo)的L929細(xì)胞半數(shù)不發(fā)生凋亡。在單 抗抑制TNF上調(diào)ECV304細(xì)胞ICAM一1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，其抑制作用 也呈良好的劑量依賴關(guān)系，1.0瑰/ml的D2、E6和F6單抗，對 ZOOU/ml TNF使ECv304細(xì)胞上ICAM一表達(dá)上調(diào)的抑制率，分別 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 為75.2%、64.3%和61.3%;三株單抗的濃度降到0.1魄/ml時(shí)， 抑制率仍可達(dá)到63.5%、57.0%和61.2%。在單抗抑制TNF誘導(dǎo)NF- KB核轉(zhuǎn)位的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先用不同濃度的三株單抗分別與TNF孵 育后，加入至ECv3O4細(xì)胞培養(yǎng)液中。刺激lh后，收獲細(xì)胞，制 備細(xì)胞核提取液，用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(eleetrophoresis mobility shift aSSay，EMSA)測定核提取液中NF一B的活性。結(jié)果表明， 三株單抗均可抑制TNF誘導(dǎo)NF一B核轉(zhuǎn)位，抑制作用與加入的中 和活性單抗呈良好的劑量依賴關(guān)系。濃度為10“g/m1DZ、E6和 F6單抗的抑制率分別為94.2%、64.9%和70.3%。三株單抗?jié)舛葹?0.1抖g/m1時(shí)，抑制率分別為75.1%、25.6%和49.5%。上述3種 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的鑒定結(jié)果表明，三株抗體均具有良好的中和活性，可 作為構(gòu)建對自身免疫性疾病等有治療作用的嵌合抗體的侯選親本 單抗。 在系統(tǒng)鑒定了三株單抗的效價(jià)和中和活性的基礎(chǔ)上，選用D2 和F6雜交瘤細(xì)胞株，利用RT一PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因。將擴(kuò)增 產(chǎn)物插入T載體，克隆出輕、重鏈可變區(qū)基因。測序得到其核昔 酸序列及其編碼的氨基酸序列，經(jīng)同源性分析，在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中 沒有發(fā)現(xiàn)完全一致的核普酸和氨基酸序列。獲得的序列符合抗體 可變區(qū)基因的特點(diǎn)，為功能性抗體的可變區(qū)基因。該基因序列在 構(gòu)建對炎癥、自身免疫性疾病等有治療作用的嵌合抗體等方面有 巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。 生物信息、學(xué)(bioinformatics)是應(yīng)用信息學(xué)技術(shù)大規(guī)模的 分析、處理和研究大分子的一門科學(xué)。借助生物信息學(xué)的研究成 果，利用蛋白質(zhì)間相互作用的模件，模擬TNF與單克隆抗體的相 互作用，精確計(jì)算各種相互作用力，定位抗體識(shí)別的表位。發(fā)現(xiàn) F6單抗與TNF的親和力(一299.92kcal)接近陽性對照(美國FDA 批準(zhǔn)臨床使用的cAZ單抗)的水平(一302.29keal)，其結(jié)合 TNF 的表位也比較好。D2的親和力稍低(一252.69kcal)，但其結(jié)合的 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論又 TNF表位十分理想。E6的親和力相
【圖文】：

分別采用不同的方法純化不同亞類的抗體。2.2.1采用蛋白A親和層析法純化D2單抗(亞類為IgGZb)(圖2)。圖2蛋白A親和層析法純化D2單抗(IgGZb)

QFF陰離子交換層析法純化E6(工gGI)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2589551