【摘要】： 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。在一定的體內(nèi)外誘導(dǎo)條件下，MSCs能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)原細(xì)胞分化。研究表明MSCs具有弱免疫原性和很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。這些生物學(xué)特性使其在組織工程、基因治療、細(xì)胞移植等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。骨髓是MSCs最為豐富，也是最可靠的來(lái)源。最近的研究表明外周血中亦存在MSCs，與骨髓穿刺取材相比，外周血MSCs采集方便且它們的生物學(xué)特性和骨髓MSCs相似：擁有多向分化能力，可遷入骨髓支持造血，還可遷入全身多種組織并在其中穩(wěn)定表達(dá)外源治療基因。隨著研究的深入，外周血MSCs將會(huì)在組織工程、造血重建、遺傳病和腫瘤基因治療等領(lǐng)域和骨髓MSCs一樣被廣泛的應(yīng)用。 作為MSCs鑒定的重要組成部分，其特異性的表面標(biāo)記一直以來(lái)都是人們研究的熱點(diǎn)，但至今尚未有突破性的進(jìn)展。通過(guò)單克隆抗體的篩選制備來(lái)尋找特異性表面分子是近年來(lái)開展的前沿技術(shù)。20世紀(jì)90年代以來(lái)研究者通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了多株人MSCs相關(guān)的單克隆抗體，目前較為特異性的有SH2、SH3、SH4、STRO-1、Thy1等，但這些單克隆抗體均與其他細(xì)胞存在交叉反應(yīng)，故至今尚無(wú)人MSCs單一的特異性表面標(biāo)記。在MSCs的研究中仍需要通過(guò)多個(gè)表面分子聯(lián)合標(biāo)記結(jié)合自我更新和多向分化潛能的特性對(duì)其進(jìn)行鑒定，這給MSCs的檢測(cè)和分選帶來(lái)一定難度。因此，制備特異性MSCs表面分子的單克隆抗體并應(yīng)用于骨髓及外周血MSCs的檢測(cè)對(duì)于MSCs的研究具有重要意義。 本課題組應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，以人骨髓MSCs免疫小鼠，獲得了穩(wěn)定分泌抗人骨髓MSCs抗體的細(xì)胞株，將其分泌的抗體命名為ZUB1。本研究旨在大量制備單克隆抗體ZUB1，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行純化及鑒定，并以此為探針應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs，為MSCs的生物學(xué)功能研究和臨床應(yīng)用提供有效的工具。 本研究將抗人骨髓MSCs單克隆抗體ZUB1雜交瘤細(xì)胞注射到經(jīng)石蠟油預(yù)處理的BALB/C小鼠腹腔，誘生腹水，每只小鼠接種1.0×10~6細(xì)胞，兩周左右后收集腹水，即可獲得大量單克隆抗體。以間接免疫熒光染色法測(cè)腹水效價(jià)為1：10~4，用鹽析法粗提單克隆抗體，再用離子交換法純化單克隆抗體。經(jīng)間接免疫熒光染色法將單克隆抗體ZUB1分別與人骨髓來(lái)源的細(xì)胞株HL-60、NB4、K562、U937、HEL、Jurkat、Raji作交叉反應(yīng)，結(jié)果未見交叉反應(yīng)，同時(shí)以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了12個(gè)間充質(zhì)和非間充質(zhì)來(lái)源的組織標(biāo)本(骨髓、韌帶、肌腱、神經(jīng)、脂肪、肌肉、血管壁、表皮、肺、肝、小腸、膽囊)，除骨髓組織外均未見交叉反應(yīng)。采用間接免疫熒光染色法檢測(cè)抗人骨髓MSCs單克隆抗體ZUB1與大鼠、犬的骨髓MSCs無(wú)交叉反應(yīng)。以上研究表明ZUB1能與人MSCs特異性結(jié)合，這是ZUB1用于MSCs檢測(cè)的前提。 分別以CD105及ZUB1為探針，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的骨髓MSCs的陽(yáng)性率分別為(97.00±1.41)％和(97.60±1.15)％。以CD105-APC、CD34-PE、CD45-PEcy5.5、GlyA-PE單克隆抗體聯(lián)合標(biāo)記及ZUB1-FITC、CD34-PE、CD45-PEcy5.5、GlyA-PE單克隆抗體聯(lián)合標(biāo)記采用多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD105+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血間充質(zhì)干細(xì)胞及ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血MSCs，初步建立了外周血MSCs的檢測(cè)方法。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，取同一份靜脈血標(biāo)本由同一個(gè)操作者重復(fù)三次，觀察結(jié)果的變異度，發(fā)現(xiàn)變異度較小，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性。本研究采集了22例健康供者外周血，檢測(cè)其中CD105+CD34-CD45-GlyA-及ZUB1+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs的含量，初步建立人外周血間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。ZUB1+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的含量為(0.161±0.108)％，CD105+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的含量為(0.037±0.023)％，，性別相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 綜上所述，本研究得出以下結(jié)果： 1．本課題組制備并純化的抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體ZUB1能與人間充質(zhì)干細(xì)胞特異性結(jié)合。 2．單克隆抗體ZUB1-FITC熒光抗體可用于檢測(cè)體外培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞。 3．初步建立了多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD105+CD34-CD45-GlyA-和ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，并證明該方法是可重復(fù)的。 4．初步建立了多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD105+CD34-CD45-GlyA-和ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。
【圖文】：

胞開始分裂增殖，部分區(qū)域形成細(xì)胞團(tuán)簇，成集落樣分布，細(xì)胞呈梭形外觀。2周后細(xì)胞融合成單層，梭形突起變長(zhǎng)，排列有明顯方向性，呈漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀(見圖2)。細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后， 12h完全貼壁，重新變成梭形細(xì)胞。細(xì)胞傳代后生長(zhǎng)迅速，增殖快，大約7d左右達(dá)完全融合，與原代細(xì)胞形態(tài)基本一致。圖2原代培養(yǎng)骨髓 MSCs(14d)X100

100101102CD166CD16692.8%103104100101102103104CD吟4CD4497.3%圖3骨髓MSCS表型流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果1.4單克隆抗體的ZUBI的鑒定1.4.1單克隆抗體ZUBI效價(jià)的鑒定間接免疫熒光染色法檢測(cè)抗體效價(jià)，免疫熒光顯微鏡卜觀察活染的MSCS，ZUBI與MSCS特異性結(jié)合，與熒光二抗結(jié)合后細(xì)胞表面顯示特異性的綠色熒光。觀察發(fā)現(xiàn)從第5孔開始熒光消失，抗體效價(jià)即為1:10‘。1.4.2單克隆抗體ZUBI在不同來(lái)源細(xì)胞中的表達(dá)經(jīng)間接免疫熒光染色法檢測(cè)ZUBI與骨髓來(lái)源的細(xì)胞株HL一60、NB4、K562、U937、IIEL、丁urkat、Roji均無(wú)交叉反應(yīng)(圖4)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2584478