發(fā)布時間：2020-02-07 22:51

【摘要】：目的:通過人工合成VEGF受體結(jié)合抑制7肽、基因重組表達VEGF受體結(jié)合抑制7肽與硫氧還蛋白(Trx)的融合蛋白Trx-RBIP,分析其生物學活性,探討它們作為抗腫瘤血管新生藥物的前景。 方法:利用噬菌體展示技術(shù)獲得的VEGF受體結(jié)合抑制7肽的氨基酸序列,人工合成該多肽,通過細胞培養(yǎng)阻斷實驗檢測其對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的抑制作用。將該短肽的基因插入質(zhì)粒pET-32 a(+),與硫氧還蛋白(Trx)在大腸桿菌BL21(DE3)中融合表達;表達產(chǎn)物經(jīng)過DEAE陰離子交換柱純化后用腸激酶酶切;酶切產(chǎn)物利用6×His純化標簽,通過Ni柱親和層析純化;通過細胞阻斷實驗檢測目的蛋白Trx-RBIP對HUVEC的抑制效果。 結(jié)果:人工合成受體結(jié)合抑制7肽與VEGFR有良好結(jié)合的能力,呈劑量依賴性抑制VEGF促HUVEC增殖的作用,最高抑制率達56.2%。成功構(gòu)建表達載體pET-32a(+)_Trx_RBIP,并成功在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得高效胞內(nèi)可溶性表達,表達的目的蛋白占細菌總蛋白的42%;DEAE陰離子交換層析純化獲得高純度的產(chǎn)物,經(jīng)腸激酶酶切獲得到抑制肽N端游離的融合蛋白Trx-RBIP。Ni離子親和柱層析純化獲得純度較高的Trx-RBIP蛋白。細胞培養(yǎng)方法檢測顯示其對細胞HUVEC有良好的抑制作用,抑制效率可達24.9%。 結(jié)論:人工合成VEGF受體結(jié)合抑制肽及其硫氧還蛋白的融合蛋白Trx-RBIP,均能競爭結(jié)合VEGFR,阻斷VEGF-VEGFR信號傳導,抑制VEGF促HUVEC增殖的作用,具有進一步開發(fā)應(yīng)用的前景。
【圖文】：

圖1VEGF的信號轉(zhuǎn)導通路同時，腫瘤細胞產(chǎn)生的免疫抑制性細胞因子包括血管內(nèi)皮生長因子GF)，能引起免疫應(yīng)答的全身性和特異性抑制(表一1)。此外，腫瘤亦可誘特異性CTL的耐受性，同時能明顯地抑制CD34前體細胞分化成為樹突。VEGF抑制由腫瘤細胞上清液誘發(fā)的樹突細胞分化，而且這種抑制可被抗F抗體所阻滯。表一l免疫抑制性細胞因子VEGF對腫瘤浸潤性淋巴細胞功能的作用作用VEGF生長抑制化抑制子產(chǎn)生抑制

rrrx一L誠-erRBIp)，即pE-T32a(+)一Tn匕RBIp表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。表達質(zhì)粒pE-T32a(+)-T。匕RBxP示意如圖4。圖4表達質(zhì)粒pET一32a(+)Jrx_RBIP示意圖.3.33重組子測序分析對所得表達質(zhì)粒EP-T32a+(--)Tn吐RBIP送上海博亞生物技術(shù)公司測序，，結(jié)果分析證明讀碼框正確，Enteorkniaes酶切位點、7膚序列及硫氧還蛋白腸x序列正確7女ThrASGyI耐ACCGACGACGACGACAAGGGCTGGTGGCTGCTGCTGCTGTTCCCGACCTyrTyrAPsAalLeuGlyGlyGlySerGluPheSer
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R341

【參考文獻】

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本文編號：2577327