本文關鍵詞：硒蛋白K對T淋巴細胞免疫應答影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：硒是一種人類和動物必需的微量元素,與許多疾病密切相關,如癌癥、神經(jīng)退行性疾病及心血管病等,并在一些重大疾病的防治中起到重要作用。硒在生物體內(nèi)主要以遺傳密碼子UGA編碼的第21種氨基酸--硒代半胱氨酸(Sec)的形式存在于蛋白質(zhì)內(nèi),通過各種硒蛋白發(fā)揮生物功能。目前在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了25種硒蛋白,但研究較清楚的僅有谷胱甘肽過氧化物酶等少數(shù)硒蛋白。硒蛋白K(Sel K)是2003年被Gladyshv實驗室鑒定出的一種新型硒蛋白,發(fā)現(xiàn)早期關于Sel K的生物學功能一直研究甚少,直到近幾年才有了一些研究進展。研究表明Sel K可能有如下功能:Sel K在心肌細胞中參與應對氧化應激;在人肝癌細胞中參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激;參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白降解;參與免疫調(diào)節(jié);參與調(diào)節(jié)巨噬細胞表面CD36棕櫚�；�,影響泡沫細胞的形成和動脈粥樣化。探究Sel K生物學功能、了解Sel K與疾病的關系具有重要的意義和應用價值。蛋白質(zhì)的組織差異表達和細胞內(nèi)定位與其生物學功能存在一定的相關性。為了解Sel K在哺乳動物各組織中的差異表達情況,本研究采用BALB/c小鼠作為研究對象,取新鮮組織脾臟、腎臟、腸、肺、腦和肝臟,通過Real time-PCR和Western blot分別檢測Sel K在m RNA和蛋白水平上的組織差異表達情況,結果顯示Sel K在脾臟中的表達明顯高于其他組織。制作小鼠脾臟組織的石蠟切片,通過免疫組織化學染色的方法,驗證了Sel K在脾臟中的高表達,并且實驗結果顯示出Sel K圍繞在細胞核周圍。采用細胞免疫熒光的方法進一步研究Sel K在小鼠T淋巴細胞內(nèi)的位置,用Alexa Fluor#174;488綠色熒光標記KDEL(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記物),同時用TRITC紅色熒光標記Sel K,結果顯示這兩種熒光重合,因此表明Sel K與KDEL定位在同一位置即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。為進一步研究Sel K在細胞免疫中所起的作用,本研究構建了用于干擾Sel K表達的干擾載體(p GPU-Sel K-mus-222、p GPU-Sel K-mus-102和p GPU-Sel K-mus-101),成功轉(zhuǎn)染小鼠T淋巴細胞,選擇干擾效率最佳的p GPU-Sel K-mus-101載體進行后續(xù)實驗。CD3體外激活干擾組和對照組T細胞,檢測細胞內(nèi)與增殖分化相關的指標變化(Ca~(2+)、IL-2Rα、IL-4)。結果表明激活后的干擾組T細胞中鈣離子濃度上升趨勢較弱與對照組有顯著性差異,即說明Sel K的減少影響了細胞活化過程中細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的升高,進一步研究表明Sel K干擾對細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)蛋白(CHERP)的表達有抑制作用,說明Sel K有可能通過CHERP來調(diào)節(jié)細胞活化過程中的鈣流。采用Real time-PCR檢測IL-2Rα的表達情況,結果顯示激活后的對照組細胞中IL-2Rα的m RNA水平顯著上升,而激活前后的干擾組細胞中IL-2Rα的m RNA水平無顯著變化,同樣說明Sel K的減少影響了細胞活化過程中IL-2Rα的表達。采用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)物上清中細胞因子(IL-4)的分泌情況,結果顯示與對照組相比,干擾組細胞上清液中IL-4的分泌顯著下降。這些結果表明Sel K可能在TCR活化誘導的小鼠T淋巴細胞增殖分化過程具有重要的作用。硒代蛋氨酸常用來體外處理細胞以達到補硒的效果,我們用不同濃度(1μM,3μM,5μM,10μM,50μM,100μM)的硒代蛋氨酸體外處理T淋巴細胞,CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)硒代蛋氨酸對T淋巴細胞變現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象,5μM硒代蛋氨酸處理T淋巴細胞24小時可以表現(xiàn)出最佳的增殖效果。Real time-PCR檢測硒代蛋氨酸對T淋巴細胞內(nèi)Sel K表達的影響,結果發(fā)現(xiàn)加硒處理組細胞中Sel K的表達顯著升高,以上結果提示適量補硒會提高Sel K的表達并且促進T淋巴細胞增殖,或因此提高機體免疫能力。以上結果表明Sel K是一種在脾臟高表達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白,Sel K干擾抑制了CHERP的表達,或因此影響到細胞活化過程中的鈣離子濃度的升高,從而阻礙了下游的信號轉(zhuǎn)導,如IL-2Rα的表達、IL-4的分泌等。此外適量濃度的硒代蛋氨酸可以提高T淋巴細胞中Sel K的表達,并且可以促進細胞增殖,或因此提高機體免疫能力。
【關鍵詞】：硒蛋白K T淋巴細胞 體外干擾 免疫應答 硒代蛋氨酸
【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 硒與硒蛋白12-16
• 1.1.1 硒12
• 1.1.2 硒蛋白12-16
• 1.2 SelK16-19
• 1.2.1 SelK的結構特征16
• 1.2.2 SelK的細胞內(nèi)定位與組織分布16-17
• 1.2.3 SelK的生物學功能研究進展17-19
• 1.3 T細胞活化的信號轉(zhuǎn)導途徑19-20
• 1.4 RNA干擾技術20
• 1.5 論文的選題與意義20-21
• 第2章 材料與方法21-45
• 2.1 實驗材料21-26
• 2.1.1 小鼠21
• 2.1.2 細胞株21
• 2.1.3 大腸桿菌菌株21
• 2.1.4 質(zhì)粒21-22
• 2.1.5 引物22
• 2.1.6 主要試劑和試劑盒22-24
• 2.1.7 實驗主要試劑的配制24-25
• 2.1.8 實驗主要儀器25-26
• 2.2 實驗方法26-45
• 2.2.1 Real time-PCR檢測SelK、IL-2Rα 和CHERP基因在mRNA水平上的表達26-29
• 2.2.2 Western blot檢測相關蛋白表達水平29-32
• 2.2.3 免疫組化檢測各組織中Sel K的表達與分布32-35
• 2.2.4 T淋巴細胞的培養(yǎng)35-36
• 2.2.5 細胞免疫熒光檢測Sel K在T淋巴細胞中的定位36-37
• 2.2.6 shRNA載體的構建與鑒定37-41
• 2.2.7 細胞轉(zhuǎn)染41-43
• 2.2.8 流式細胞術檢測鈣流43
• 2.2.9 ELISA檢測細胞因子43-44
• 2.2.10 CCK-8 檢測細胞增殖情況44-45
• 第3章 實驗結果45-64
• 3.1 SelK在小鼠中的組織分布45-48
• 3.1.1 SelK在小鼠組織中mRNA水平上的差異45-47
• 3.1.2 SelK在小鼠各組織中蛋白水平上的表達差異47-48
• 3.2 SelK的細胞內(nèi)定位48-49
• 3.2.1 免疫組化檢測Sel K在小鼠脾臟中的分布48-49
• 3.2.2 細胞免疫熒光結果49
• 3.3 干擾質(zhì)粒的構建與鑒定49-50
• 3.3.1 干擾質(zhì)粒的雙酶切鑒定49-50
• 3.3.2 重組質(zhì)粒的測序鑒定結果50
• 3.4 體外干擾Sel K對T淋巴細胞的影響50-61
• 3.4.1 shRNA體外干擾小鼠T淋巴細胞SelK的表達50-53
• 3.4.2 SelK干擾對T淋巴細胞中鈣流的影響53-56
• 3.4.3 SelK干擾對細胞內(nèi)CHERP的影響56-57
• 3.4.4 SelK干擾對細胞內(nèi)IL-2R的影響57-59
• 3.4.5 SelK缺乏對T淋巴細胞中細胞因子的影響59-61
• 3.5 體外加硒對T淋巴細胞增殖以及SelK表達的影響61-64
• 3.5.1 硒代蛋氨酸對T淋巴細胞增殖的影響61-62
• 3.5.2 硒代蛋氨酸對T淋巴細胞中SelK表達的影響62-64
• 第4章 討論64-67
• 第5章 結論67-68
• 參考文獻68-73
• 附錄73-77
• 致謝77-78
• 攻讀碩士期間的研究成果78-79

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 田金可;吳秋玨;王恬;;硒的抗氧化功能及在動物生產(chǎn)中的應用[J];中國飼料;2011年23期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李靜;基因工程方法構建高GPx活性的含硒抗氧化酶[D];吉林大學;2008年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 趙斌;硒對大豆生理生化與產(chǎn)質(zhì)量影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2006年

  本文關鍵詞：硒蛋白K對T淋巴細胞免疫應答影響的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：257296