【摘要】： 很多研究將Sertoli細胞在神經(jīng)前體細胞分化中的作用歸結(jié)為Sertoli細胞分泌的細胞因子和營養(yǎng)因子等分泌物上,而從Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)角度,通過Notch受體與配體的相互作用,來探討細胞與細胞間的相互接觸在神經(jīng)前體細胞分化中的意義,國內(nèi)外尚未見報道。因而我們從Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子方面,對Sertoli細胞在神經(jīng)前體細胞分化作用機理進行了深入研究。現(xiàn)將四部分內(nèi)容分述如下: 第一部分:大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞的分離培養(yǎng)及其增殖分化特性鑒定 目的:神經(jīng)前體細胞是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力,在特定條件下,能夠向特定類型神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的細胞。本實驗通過體外分離和培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞,對神經(jīng)前體細胞增殖和分化特性進行鑒定。 方法:分離2周齡大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng),使用免疫細胞熒光染色技術(shù)對細胞的分化特性進行鑒定。 結(jié)果:誘導(dǎo)神經(jīng)前體細胞增殖的有絲裂原包括堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子等。我們的實驗結(jié)果表明EGF、bFGF和GDNF可促進神經(jīng)前體細胞的增殖及神經(jīng)球的克隆形成,并獲得了Nestin陽性的神經(jīng)前體細胞,其可分化為分別表達β-III tubulin、GFAP和GalC的陽性細胞。 結(jié)論:神經(jīng)前體細胞在體外大量擴增后,植入腦組織內(nèi)或通過基因重組后再植入腦內(nèi),可用來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如帕金森病或阿爾茨海默病。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)前體細胞的增殖與分化是一個復(fù)雜的進程,存在細胞自身基因調(diào)控和外來信號調(diào)控兩種機制。因而,目前需要積極尋找可靠的方法來有效地分離和擴增神經(jīng)前體細胞,并精確地了解其增殖與分化特性。本研究第一部分利用大鼠的大腦皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)前體細胞,觀察了bFGF、EGF和GDNF三種生長因子對神經(jīng)前體細胞在體外培養(yǎng)增殖和分化的影響,體外分離和培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞,在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培養(yǎng)基中培養(yǎng),具有不斷增殖和多向分化的能力,符合神經(jīng)前體細胞的特點,為神經(jīng)前體細胞的定向分化研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分:Sertoli細胞對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞的誘導(dǎo)分化作用研究 目的:同一來源的神經(jīng)前體細胞移植到不同部位后,其分化結(jié)果也不相同,但往往與接受移植部位的細胞相似,提示外來信號調(diào)控作用的重要性。而且,在不同因素影響下,神經(jīng)干細胞還具有橫向分化潛能。本部分主要研究Sertoli細胞對體外培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞生長分化的作用特點,及向多巴胺能神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)作用。 方法:將大鼠Sertoli細胞與14d大鼠皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞體外共培養(yǎng),免疫組化檢測神經(jīng)干細胞標記物Nestin ,神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞標記物β-Ⅲtubulin、GFAP和GalC,及多巴胺能神經(jīng)元標記物酪氨酸羥化酶(TH)的表達情況。 結(jié)果:隨著共培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)干細胞中GFAP陽性細胞數(shù)量逐漸減少,而β-Ⅲtubulin陽性細胞數(shù)增多,并出現(xiàn)TH陽性的神經(jīng)元。 結(jié)論:把胎鼠或成年鼠前腦神經(jīng)干細胞移植給經(jīng)亞致死量照射破壞了造血系統(tǒng)的同種宿主的骨髓,發(fā)現(xiàn)后者出現(xiàn)了供者源性的骨髓樣細胞、淋巴細胞和早期的造血干細胞;把從人胚胎和成年小鼠快速分離的神經(jīng)干細胞與成肌細胞共培養(yǎng),結(jié)果神經(jīng)前體細胞分化為骨骼肌細胞。證實了神經(jīng)干細胞有著更大的分化潛能。Clarke等發(fā)現(xiàn),成年鼠腦的干細胞能在雞胚環(huán)境中被誘導(dǎo)形成所有的胚層。這些研究結(jié)果顯示,環(huán)境的指導(dǎo)性信號對神經(jīng)干細胞分化的重要作用。我們的實驗結(jié)果表明:Sertoli細胞抑制體外培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞的生長,但具有顯著的促神經(jīng)元分化的作用,并能夠誘導(dǎo)與其共培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元。 第三部分:Sertoli細胞共培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞分化中Notch信號相關(guān)基因表達分析 目的:對那些在發(fā)育期調(diào)控細胞決定和細胞分化的基因進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是具備這些功能的重要家族之一。它在大量的組織和器官的發(fā)育中發(fā)揮重要作用,調(diào)控著組織類型及形態(tài)的發(fā)生。本部分研究主要檢測與Srtoli細胞共培養(yǎng)條件下大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞分化過程中Notch信號相關(guān)分子的表達變化,分析Notch信號途徑在神經(jīng)前體細胞分化過程中的可能作用。 方法:本實驗通過神經(jīng)前體細胞與Srtoli細胞共培養(yǎng),用Real-time PCR相對定量法,以β-actin為內(nèi)對照,分別檢測Notch受體Notch1、Notch2、Notch3、Notch4,及其配體Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2,以及Hes1、Ngn1基因的表達變化。 結(jié)果:養(yǎng)細胞匯片后第5d, sertoli細胞Notch1～4基本表達維持不變;其配體Jagged2表達較高,但不表達Delta1;同時也不表達Hes1、Ngn1。神經(jīng)前體細胞Notch表達水平較高,尤以Notch1為高;而其配體以Jagged1、Jagged2表達較高,前神經(jīng)因子Hes1相對有較高的表達,而Ngn1表達較低。細胞共培養(yǎng)條件下,Notch受體、配體以及Hes1與神經(jīng)前體細胞組相比都有明顯的下調(diào),而Ngn1卻相對有所提高。 結(jié)論:在干細胞發(fā)育過程中,細胞膜表面分子Notch通過結(jié)合其配體Delta或Jagged而在干細胞和周圍細胞間傳遞信號,這種細胞間的相互作用可以調(diào)控干細胞的分化。在哺乳動物,Notch信號通過CBF1激活E(spl)的同源物Hes[Hairy and E(spl)]1/5,并影響Ngn(Neurogenins)等前神經(jīng)因子的表達,從而調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的分化。Notch在細胞間傳導(dǎo)相互作用的信號,并通過這種鄰近細胞間的信號傳遞來精確調(diào)控各譜系細胞分化。Notch信號通路在哺乳動物CNS發(fā)育中參與神經(jīng)發(fā)生過程,決定著CNS祖細胞是選擇繼續(xù)增殖還是向神經(jīng)元分化。一般而言,Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活維持神經(jīng)干細胞的穩(wěn)定狀態(tài),抑制定向分化;但另一方面,也有證據(jù)表明激活Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又可以加速并不可逆地促進神經(jīng)干細胞向成膠質(zhì)細胞分化。本研究第三部分應(yīng)用實時熒光定量PCR法,檢測了與sertoli細胞共培養(yǎng)神經(jīng)前體細胞分化過程中Notch相關(guān)基因Notch1～4、Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2、hes1和ngn1的表達變化,實驗表明在與sertoli細胞共培養(yǎng)條件下,神經(jīng)前體細胞的分化特點與Notch信號相關(guān)分子的表達變化相關(guān)。Sertoli細胞可通過Notch配體的作用,調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞Notch信號分子的表達。在共培養(yǎng)條件下,Sertoli細胞對神經(jīng)前體細胞Hes1表達有抑制作用,但對Ngn1有正向調(diào)節(jié)作用,從而影響神經(jīng)前體細胞的分化。 第四部分:Hes1基因真核表達載體的構(gòu)建及瞬時表達在大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞分化中的作用 目的:隨著神經(jīng)前體細胞分離、提純及體外培養(yǎng)等研究的深入,對內(nèi)在和外在因子控制神經(jīng)前體細胞增殖和分化的研究也取得了顯著進步。目前研究證明,發(fā)生在不同組織內(nèi)的同一機制調(diào)控著該關(guān)鍵步驟,而其中涉及最多者為bHLH基因家族。bHLH是一組轉(zhuǎn)錄因子,通過一個堿性區(qū)域和一個HLH域的異二聚化與DNA形成特定的接觸。Notch信號的下游基因E(spl)/Hes就是其中之一。本實驗通過克隆大鼠Hes1基因并構(gòu)建真核表達載體pCDNA3.1-Hes1,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞,獲得高表達Hes1基因的神經(jīng)前體細胞克隆。以探討Hes1基因高表達對神經(jīng)前體細胞分化的影響。 方法:從大鼠腦組織中提取總RNA,用RT-PCR方法獲得Hes1基因的全長cDNA,插入pGEM-T-Easy克隆載體中進行序列測定,測序正確后將其亞克隆至表達載體pCDNA3.1,利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)前體細胞,經(jīng)G418篩選獲得抗性細胞克隆,采用RT-PCR方法鑒定Hes1基因在神經(jīng)前體細胞基因組中的存在,實時熒光定量PCR檢測Hes1基因的過表達情況。 結(jié)果:經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實目的基因已插入重組質(zhì)粒,RT-PCR證明經(jīng)G418篩選得到的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)前體細胞克隆的基因組DNA中存在Hes1基因,實時熒光定量PCR進一步證明轉(zhuǎn)基因神經(jīng)前體細胞Hes1基因的mRNA呈高表達。 結(jié)論:不同的bHLH因子具有不同的決定和分化的功能,經(jīng)常作為一個相關(guān)蛋白質(zhì)家族而存在,按時空順序短暫表達于細胞系分化的不同階段。早期表達因子參與祖細胞的決定,而晚期表達因子則參與分裂細胞的終期分化,早期表達蛋白質(zhì)激活晚期蛋白質(zhì)表達。研究顯示,Notch和它的下游效應(yīng)器Hes基因,以及同源基因Emx2具有維持腦內(nèi)多潛能干細胞狀態(tài)的功能,而Ngn1/2和Mash1和Pax6是神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元分化的必要條件。Kabos等發(fā)現(xiàn)阻斷Hes1表達促進中樞神經(jīng)干細胞分化為γ-氨基丁酸神經(jīng)元。神經(jīng)元形成后,Hes因子的激活促進星形膠質(zhì)細胞的分化,而前神經(jīng)bHLH因子Ngn抑制星形膠質(zhì)細胞的分化。本實驗通過克隆大鼠Hes1基因,構(gòu)建真核表達載體pCDNA3.1-Hes1,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞,研究觀察了Hes1基因過表達對神經(jīng)前體細胞Ngn1表達的影響,以及這些變化在神經(jīng)前體細胞分化的作用。實驗成功構(gòu)建了大鼠Hes1基因的真核表達載體,獲得了穩(wěn)定表達Hes1基因的神經(jīng)前體細胞克隆,細胞培養(yǎng)實驗表明:Hes1基因高表達可抑制神經(jīng)前提細胞Ngn1的表達,并促進神經(jīng)前提細胞向神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【共引文獻】

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