【摘要】： 目的人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)廣泛流行于世界各地，是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原。目前尚無(wú)安全、有效的疫苗用于預(yù)防RSV感染。RSV兩個(gè)重要的糖蛋白膜表面表達(dá)的融合蛋白F(fusion protein，F(xiàn))和粘附蛋白G，是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，也是疫苗研究發(fā)展的重要內(nèi)容。與G蛋白相比，F(xiàn)蛋白有更多的抗原識(shí)別位點(diǎn)，不同亞型間F蛋白高度保守、同源性高達(dá)86％，能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，針對(duì)F的中和抗體具有交叉保護(hù)作用，，是RSV疫苗研究的最重要的靶抗原。輔助病毒依賴型腺病毒載體(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)主要用于基因治療研究，作為疫苗載體的研究起步較晚，尚沒(méi)有作為黏膜基因釋放系統(tǒng)用于疫苗研究的報(bào)道。HDAd與腺病毒具有相同的細(xì)胞嗜性，對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞具有高效感染的能力，且能長(zhǎng)期、持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，具有重要的研究與使用價(jià)值。本研究擬構(gòu)建可表達(dá)A亞型RSV F蛋白的輔助病毒依賴型腺病毒載體(HDAd／F)，并完成大量制備、純化和F蛋白的體外表達(dá)鑒定，為進(jìn)一步的體內(nèi)免疫效果和免疫保護(hù)作用研究奠定基礎(chǔ)。 方法將帶有CMV啟動(dòng)子序列的F基因亞克隆至克隆載體pSC11，鑒定正確后，克隆至HDAd質(zhì)粒pSC15B，構(gòu)建pSC15B／F HDAd重組質(zhì)粒，PmeⅠ消化pSC15B／F去除原核復(fù)制元件及抗性基因，獲得HDAd／F DNA分子，經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293Cre4細(xì)胞，16 h后感染輔助病毒，收獲HDAd／F載體粗提液，隨后以HDAd／F粗提液及輔助病毒連續(xù)共感染293Cre4細(xì)胞直至HDAd／F達(dá)到復(fù)制極限，同時(shí)以可表達(dá)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)報(bào)告基因的HDAdLacZ載體作為平行對(duì)照監(jiān)測(cè)載體復(fù)制過(guò)程。大量制備HDAd／F，CsCl密度梯度及等密度梯度兩次超速離心純化，利用分子生物學(xué)技術(shù)體外鑒定HDAd／F表達(dá)情況。 結(jié)果成功構(gòu)建了可表達(dá)RSV F蛋白的HDAd／F載體，通過(guò)與輔助病毒共感染293Cre4細(xì)胞及CsCl梯度法超速離心制備了大量純化的HDAd／F載體，透射電鏡觀察顯示HDAd的直徑約為70 nm，具有典型的腺病毒形態(tài)，運(yùn)用分光光度測(cè)定法分析表明純化后HDAd載體顆粒濃度為：7.4×10~(12)(vp／ml)，體外感染293細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)到F基因有轉(zhuǎn)錄，Western blot分析表明F蛋白有特異性表達(dá)。 結(jié)論成功構(gòu)建HDAd／F載體并在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，為體內(nèi)免疫學(xué)效力試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，為研制RSV疫苗提供了一種新方法。
【圖文】：

圖3制備HDA出F載體的Cre幾o(hù)xP系統(tǒng)示意圖Fig3TheCre幾o(hù)xPsystemforgeneratingHDAd/Fveetors留約4ml，用吸管重懸沉淀，置于一80℃冰箱，30min，取出病毒置于室溫或37℃

在顯影液中顯影Zmin左右;定影10min至膠片透明;片10min，然后晾干保存。Cll鄺A3.1(+)/F重組質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)室已法鑒定，在此基礎(chǔ)上使用限制性和pSCH，回收目的片段，將含連接，轉(zhuǎn)化、挑菌和搖菌，然后顯示，得到一條約2100bp的電
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 呂治林;兒童疫苗的現(xiàn)狀與展望[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè);2000年01期

2 朱汝南 ,鄧潔,王芳,錢淵,盧競(jìng),車?yán)?2000年秋冬至2002年夏北京地區(qū)急性呼吸道感染病毒病原學(xué)研究[J];臨床兒科雜志;2003年01期

3 鄧潔;錢淵;朱汝南;王芳;趙林清;;2000年冬-2006年春北京地區(qū)急性呼吸道感染患兒中呼吸道合胞病毒的監(jiān)測(cè)[J];中華兒科雜志;2006年12期

4 謝健屏,常汝虛;呼吸道合胞病毒在中國(guó)的流行季節(jié)[J];中國(guó)臨床醫(yī)生;1999年02期

本文編號(hào)：2567576