發(fā)布時間：2019-10-14 05:41

【摘要】：目的 通過以下兩方面初步探討EBI3的功能：①構(gòu)建人EBI3的四個缺失突變體確定EBI3蛋白與Sedlin之間相互作用的區(qū)域；②探討EBI3在小鼠臍帶血管及胎盤的表達。 方法 ①pACT2-EBI3是我們以Sedlin基因作為誘餌篩選人類胎盤cDNA文庫獲得的一個克隆。該質(zhì)粒編碼EBI3蛋白氨基酸54～229，而這部分氨基酸的編碼序列存在NcoI和BamHI各1個酶切位點。將pACT2-EBI3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中擴增，提取質(zhì)粒并利用上述兩種限制性酶其中之一分別切割，均可得到大小不一的兩個片段，每個片段分別回收純化。大片段在T_4DNA連接酶作用下自連，分別形成缺失突變體pEBI3 m1和pEBI3 m2。小片段分別插入pACT2的NcoI和BamHI酶切位點，則得到缺失突變體pEBI3 m3和pEBI3 m4。4個缺失突變體分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中擴增，提取質(zhì)粒并進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。將以上構(gòu)建的4個缺失突變體分別與pAS-Sedlin共轉(zhuǎn)化入酵母菌Y190，再進行濾膜印跡實驗測定β-半乳糖苷酶活性，即呈藍色的克隆才是兩種蛋白可能相互作用的陽性克隆。②昆明小鼠交配后，以觀察到陰道栓計為妊娠第0.5d來確定胚齡，再按照準(zhǔn)確的胚齡分別取12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d、17.5d、18.5d的小鼠胎盤及臍帶。③使用EBI3多克隆抗體通過免疫組織化學(xué)SABC法檢測EBI3蛋白的存在，然后通過HE染色和維多利亞藍-麗春紅染色(P／VB雙重組合染色)了解臍帶組織結(jié)構(gòu)，以便初步確定陽性細胞類型。 結(jié)果 ①限制性內(nèi)切酶酶切鑒定證明所構(gòu)建質(zhì)粒為以上4個EBI3突變體重組質(zhì)粒，β-半乳糖苷酶活性測試表明這4個克隆均為陽性。②12.5～18.5d小鼠胎盤中均未見EBI3表達。③結(jié)合臍帶血管組織結(jié)構(gòu)觀察，12.5～18.5d小鼠臍動、靜脈平滑肌細胞呈EBI3免疫陽性反應(yīng)。隨著胚齡改變，免疫反應(yīng)強度未見明顯變化。
【圖文】：

圖IB:各突變體編碼的EBIschematiedigarmabaoutconturCtiononsUrtetion，B.themainoacidergio12345

平滑肌層多為2一3層，分布稀疏，，外膜較中膜厚，主要由結(jié)締組織成分組成，偶爾也可見到少量平滑肌細胞。隨著孕期的發(fā)展，臍動、靜脈的管壁組織結(jié)構(gòu)未見明顯變化。(圖4)3.4.ZP八B雙重組合染色臍動脈管壁的內(nèi)膜可見到彈性膜(呈藍綠色)，但在靠近內(nèi)膜的中膜也可見到明顯的彈性膜，并且中膜主要由平滑肌細胞(呈淡黃色)組成，在離內(nèi)膜較遠的中膜也能見到不明顯的的彈性膜，外膜可見到膠原纖維(呈紅色)，未見到外彈性膜。臍靜脈管壁的內(nèi)膜未見到明顯的彈性膜，中膜和外膜均與臍動脈的組成無明顯差異。(圖5)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R373

【參考文獻】

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1 范禮斌;脊椎骨骨骺蛋白的細胞轉(zhuǎn)染定位[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2004年02期

本文編號：2549111