【摘要】： 吸煙是呼吸系統(tǒng)疾病的危險(xiǎn)因素,是引起慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的主要原因。氣道(氣管和支氣管)上皮作為抵御外來損傷因素的第一道防線,吸入香煙煙霧可以造成其損傷。在修復(fù)過程中,損傷周圍的上皮細(xì)胞(airway epithelial cell, AEC)分裂增殖、分化和遷移,以重新覆蓋受損傷區(qū)域,這一系列細(xì)胞活動(dòng)過程均有賴于微管及其相關(guān)蛋白之間復(fù)雜的相互作用。近年來研究顯示,結(jié)腸腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli, APC)蛋白可以通過其分子羧基末端的微管結(jié)合區(qū)域與微管正極直接結(jié)合,故被稱為微管正極示蹤蛋白(plus-end tracking proteins),它以微管連接蛋白的形式,調(diào)節(jié)微管組裝、引發(fā)微管成束以及增加微管穩(wěn)定性,被視為一種新的微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein, MAPs),積極促進(jìn)修復(fù)中細(xì)胞活動(dòng)的進(jìn)行。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶,具有廣泛的作用底物,參與多種細(xì)胞生命過程。APC蛋白作為GSK3β的底物之一,被GSK3β磷酸化之后與微管的結(jié)合減少,導(dǎo)致微管解聚;GSK3β還能夠磷酸化其它多種微管相關(guān)蛋白,減弱它們穩(wěn)定微管的能力,進(jìn)而影響損傷修復(fù)中細(xì)胞遷移等細(xì)胞活動(dòng);GSK3β活性也受其它激酶的磷酸化調(diào)節(jié),引起活性抑制�；谝陨腺Y料,我們推測APC蛋白、GSK3β可能參與修復(fù)過程中的細(xì)胞遷移、分裂增殖等活動(dòng),從而在氣道上皮損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。 目的:本研究通過建立小鼠吸煙的動(dòng)物模型,檢測APC蛋白、GSK3β在氣道上皮不同損傷修復(fù)時(shí)期中的動(dòng)態(tài)變化,初步探討二者在吸煙致氣道上皮損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制,繼而為進(jìn)一步深入探討氣道上皮損傷后的修復(fù)機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:本實(shí)驗(yàn)用相同濃度(每次燃燒8支卷煙,每支10 min,換煙時(shí),停止吸煙5 min,每次2 h,每天1次,每周7次)的香煙主流煙霧分別使小鼠吸入1周、4周、8周和12周,建立吸煙致氣道上皮損傷修復(fù)的動(dòng)物模型,以未吸煙小鼠作為對照。采用HE染色觀察損傷修復(fù)過程中氣道上皮的形態(tài)學(xué)特征;免疫組織化學(xué)檢測APC蛋白、GSK3β在氣道上皮的表達(dá)變化;Western印跡技術(shù)檢測肺組織中APC蛋白、GSK3β以及磷酸化GSK3β(P-GSK3β)的總表達(dá)量;免疫熒光共聚焦成像觀察APC蛋白、GSK3β在氣道上皮細(xì)胞內(nèi)的分布變化。 結(jié)果:①HE染色結(jié)果顯示:對照組氣道粘膜上皮結(jié)構(gòu)完整,纖毛排列整齊,細(xì)胞間連接緊密;吸煙1 w氣道上皮細(xì)胞纖毛減少、倒伏,細(xì)胞間連接疏松,細(xì)支氣管壁有少數(shù)炎細(xì)胞浸潤;吸煙4 w氣道上皮細(xì)胞壞死、脫落,多數(shù)上皮細(xì)胞間連接松散,氣道上皮完整性部分被破壞,細(xì)支氣管壁有較多炎細(xì)胞浸潤;吸煙8 w氣道上皮細(xì)胞排列整齊、纖毛減少,上皮細(xì)胞之間連接未見明顯異常;吸煙12 w損傷情況與吸煙4 w相似,但伴有局灶性氣道粘膜基底層細(xì)胞增生,細(xì)胞層次增多。②免疫組化染色結(jié)果:APC蛋白在吸煙1 w時(shí)細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)較對照組增強(qiáng)(P0.05),吸煙4 w時(shí)APC蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P0.01),吸煙8 w、12 w時(shí)APC蛋白表達(dá)均較吸煙4 w增強(qiáng)(P0.05)但與對照組比較無顯著性差異;GSK3β在吸煙組各階段細(xì)支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)均較對照組減弱(P0.01或P0.05),吸煙8 w時(shí)GSK3β表達(dá)較吸煙1 w時(shí)增強(qiáng)(P0.01)。③Western印跡顯示:APC蛋白、GSK3β在各實(shí)驗(yàn)組肺組織的含量變化與免疫組化表達(dá)結(jié)果一致;吸煙組各階段GSK3β磷酸化水平均高于對照組,以吸煙1 w時(shí)表達(dá)最高。④熒光共聚焦成像顯示:APC蛋白紅色熒光顆粒在對照組氣道上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈均勻彌散分布,吸煙1 w、8 w時(shí),紅色熒光顆粒在氣道上皮細(xì)胞腔面和側(cè)面質(zhì)膜下聚集成簇狀,吸煙4 w時(shí)紅色熒光強(qiáng)度減弱,吸煙12 w時(shí)熒光顆粒分布與對照組相似;GSK3β在對照組和吸煙組氣道上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)都呈均勻彌散分布,無定位改變。 結(jié)論:①吸煙對氣道上皮存在持續(xù)性的損害作用,同時(shí)也存在機(jī)體對其損傷的修復(fù),從而使氣道上皮反復(fù)呈現(xiàn)損傷、修復(fù)重建和再損傷的形態(tài)學(xué)特征。②吸煙致氣道上皮損傷修復(fù)過程中APC蛋白表達(dá)量及在胞質(zhì)內(nèi)分布呈動(dòng)態(tài)變化,同時(shí)伴有GSK3β表達(dá)量下調(diào)和磷酸化水平增高。 由上述結(jié)果我們推測:APC蛋白、GSK3β可能通過參與微管動(dòng)力學(xué)和功能的調(diào)節(jié),影響修復(fù)中細(xì)胞遷移、分裂增殖等生物學(xué)活動(dòng),從而在氣道上皮損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖 1. 吸煙小鼠氣道上皮損傷修復(fù)過程中肺組織切片 HE 染色結(jié)果A：對照組氣道粘膜上皮結(jié)構(gòu)完整,纖毛排列整齊，細(xì)胞間連接緊密；B：吸煙 1 w氣道上皮細(xì)胞纖毛減少、倒伏，，細(xì)胞間連接疏松，少數(shù)細(xì)胞腫脹；C：吸煙 4 w可見氣道上皮細(xì)胞壞死、脫落,多數(shù)上皮細(xì)胞間連接松散，氣道上皮完整性部分被破壞；D：吸煙 8 w氣道上皮細(xì)胞排列整齊、纖毛減少, 細(xì)胞間連接未見明顯改變，受損傷上皮逐漸被修復(fù)。 比例標(biāo)尺：50 μmFig.1. HE staining in the lung of smoking mice with experimental airway epitheliuminjury at different phases. A: Control, the normal airway epithelium with intactstructure, regularly arranged cilia and tight intercellular junction. B: w 1, minor injuryphase, the cilia became decreased and the intercellular junction was loose. C: w 4,serious injury, showing necrosis and exfoliation of the airway epithelial cells, thestructure integrity of airway epithelial cells was destroyed. D: w 8, the injured airway

圖 2. 吸煙小鼠氣道上皮損傷修復(fù)過程中 APC 蛋白免疫組化染色結(jié)果A：對照組細(xì)支氣管上皮細(xì)胞 APC 蛋白表達(dá)（A=0.399 ± 0.060）； B：吸煙 1 w 細(xì)支氣管上皮細(xì)胞 APC 蛋白表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)（A=0.458 ± 0.062; P<0.05）；C：吸煙 4 w 細(xì)支氣管上皮細(xì)胞 APC 蛋白表達(dá)明顯低于對照組（A=0.339 ± 0.056; P <0.01）；D： 吸煙 8 w細(xì)支氣管上皮細(xì)胞 APC 蛋白表達(dá)較吸煙 4 w 增強(qiáng)（A=0.387 ± 0.041; P<0.05）但與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。 比例標(biāo)尺：50 μmFig.2. Immunohistochemical staining of APC protein in the airway epithelial cells ofsmoking mice at different phases. The brown staining is the positive expression. A:expression of APC protein in control (A=0.399 ± 0.060). B: w 1, expression of APCprotein obviously enhanced (A=0.458±0.062; P<0.05 vs control). C: w 4, expressionof APC protein significantly decreased (A=0.339 ± 0.056; P <0.01 vs control). D: w 8,
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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3 許三林,吳人亮,陳春蓮,郝春榮;上皮鈣粘附素在吸煙小鼠呼吸道上皮損傷修復(fù)中表達(dá)的研究[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;1999年07期

本文編號：2548890