【摘要】：大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)經(jīng)過一系列翻譯后修飾，最后定位到自噬體膜上，目前已經(jīng)作為自噬體的分子標記廣泛應用于自噬過程和與之相關(guān)的許多生理，病理過程的研究中。我們以前報道了3個人LC3家族的新成員，LC3A，LC3B和LC3C。LC3A和LC3C與酵母Atg8和大鼠LC3相類似，經(jīng)歷了一系列的翻譯后修飾，包括羧基末端的切割；但LC3B羧基末端不被切割，產(chǎn)生了一種不同于大鼠LC3的依賴于羧基末端未被切割的賴氨酸(Lys122)的新的翻譯后修飾方式。最近日本學者報道人LC3B的羧基末端也能被切割，并進一步在Gly120產(chǎn)生修飾，與大鼠LC3類似。 為了闡述清楚這個問題，我們首先證明人LC3B由于可變剪接產(chǎn)生了兩種亞型，LC3B-α和LC3B-β，分別具有或缺失Arg70。LC3B-α和LC3B-β在人的多種組織中都廣泛表達。LC3B-α發(fā)生了典型的羧基末端切割反應，而且定位到自噬體膜上；LC3B-β不能。當LC3B-α的Gly120突變時，其羧基末端不能切割，此時LC3B-α的電泳行為與LC3B-β相同，且都受Lys122／121的影響。通過質(zhì)譜分析，我們發(fā)現(xiàn)盡管LC3B-β和LC3B-β-K121A在電泳上表現(xiàn)為相差2KD，但它們的分子量幾乎相同，也就是說LC3B-β上沒有發(fā)生修飾。我們還對LC3B-α和LC3B-β的結(jié)構(gòu)進行同源模擬，結(jié)果表明LC3B-α和LC3B-β的羧基末端具有不同的結(jié)構(gòu)：LC3B-α的羧基末端游離于其蛋白主體之外，不停的運動；而LC3B-β的羧基末端與其蛋白主體緊密結(jié)合在一起，是固定不動的，，進一步從結(jié)構(gòu)水平上解釋了為什么LC3B-α和LC3B-β的羧基末端具有不同的切割反應。GST pull-down實驗證明ATG4B與LC3B-α和LC3B-β都能相互作用，而且ATG4B能在體外切割LC3B-α的羧基末端。將LC3B-α和LC3B-β同時轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)LC3B-β能抑制LC3B-α羧基末端的切割，并影響LC3B-α的修飾和自噬體膜定位，提示LC3B-β在體內(nèi)可能具有負調(diào)節(jié)自噬體形成的功能。 此外，本文還對本實驗室以前克隆的大鼠LC3A和LC3B的翻譯后修飾方式進行了進一步的研究。發(fā)現(xiàn)大鼠LC3A和LC3B經(jīng)過了與大鼠LC3相同的翻譯后羧基末端切割和修飾反應，并且都能定位到自噬體膜上。而且羧基末端保守的甘氨酸 (Gly120)是大鼠LC3A和LC3B翻譯后羧基末端切割和修飾，以及自噬體膜定位所必須的。因此我們認為大鼠LC3A和LC3B能作為新的自噬體分子標記，廣泛應用于對自噬過程以及與之相關(guān)的生理和病理過程的研究之中。
【圖文】：

復旦大學博士論文第一章人LC3B一p的鑒定及其對LC3B一a的負反饋調(diào)節(jié)機制R68An一noncidsMl167Pr心·硯、tR秘AS’一AUG-一AUU一APos且t一onoth幾一月”a藝一el一rI685.993j一guaaU-一aaUag-卜一.Intron4一祠38885R69R7O人一AGG一CGC一V125一GUG一UA八3994.029R68Anlinoae鑫dsI，re·n一RNA5‘·AUG一“一AUU一AG·guaau-，二aauag·A一AG‘卜一一一Intron4‘一月R69V124一CGC一、·GUG。UAA一:PO，.11。一、合一hu.”“n‘hrl635.99338885，994032圖1.人LC3B基因第4個內(nèi)含子的3’末端發(fā)生可變剪接.(A)LC3B一a剪接形式具有3個連續(xù)的精氨酸殘基R68，R69，和R70.(B)LC3B一p剪接形式只有兩個連續(xù)的精氨酸殘基，相對應于其氨基酸序列，編號為R68，R69，缺少R70.L哪Ba

圖3.藝乙朋、和乙之議了問釣組織表達譜.(A)乙‘召刀艱不}以藝J刀節(jié)在18種人組織cDNA和2種人gtlo門1cONA(以“*”標記)文庫中的表達情況.(B)乙￡萬口渭在18種人組織種相對于乙乙扮公的表達卜度(LC3B一p/LC3B一a).接著我們以人肝gtlo/11eD、A文庫為模板擴增LCB戍尺產(chǎn)物直接測序，結(jié)果證實產(chǎn)物是LC3B一a和LC3B一日的編碼區(qū)(O尺F)，將的混合物(圖4)。.﨑CAT仁C幾G，.寧人C.C^‘T七Te甲.C6G決CAG.臼GLc，B‘幾血GA下AA，T幾
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R341

【共引文獻】

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本文編號：2547698