【摘要】： 目前世界上有1.7億人感染丙型肝炎病毒,危害嚴(yán)重,但目前還沒有特效的治療技術(shù)和方法。找出肝細胞中與HCV反式調(diào)節(jié)相關(guān)的基因,并進一步弄清具體作用機制、作用效應(yīng)及連帶影響,對明確HCV的致病機理,尋找有效防治方法有重要意義。HCV p7TP2是利用基因芯片篩選的HCV p7蛋白下調(diào)表達的靶基因,其許多功能仍需要進一步研究。本試驗主要應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)、抑制性消減雜交技術(shù)、原核表達技術(shù)、實時熒光定量PCR等方法研究p7TP2基因的生物學(xué)功能。 1.以HepG2細胞cDNA為模板克隆出p7TP2基因,編碼區(qū)為495bp (核苷酸),應(yīng)用生物信息學(xué)分析此基因位于8q24.3,半衰期為30h,屬于不穩(wěn)定蛋白,疏水指數(shù)較高,預(yù)測可能為具有不緊密的球蛋白結(jié)構(gòu),具有信號肽及兩個跨膜結(jié)構(gòu)域。 2.應(yīng)用實時熒光定量PCR驗證HCV p7蛋白下調(diào)p7TP2基因的表達,并應(yīng)用抑制性消減雜交篩選并構(gòu)建p7TP2下調(diào)表達基因的消減文庫,同源性分析p7TP2下調(diào)表達的基因主要位于線粒體,并與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡的信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。 3.利用原核表達系統(tǒng),構(gòu)建融合表達載體,IPTG誘導(dǎo)表達融合蛋白,證明其相對分子量約為33000,純化融合蛋白,并免疫兔子,制備多克隆抗體,經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定、蛋白質(zhì)免疫印跡,此抗體具有較高效價和特異性。 4.免疫組織化學(xué)檢測p7TP2蛋白在陽性組織中分布在細胞漿,且在正常組織的表達量比病理組織高。構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與p7TP2的融合基因,轉(zhuǎn)入不同的細胞系HepG2及COS-7,熒光顯微鏡觀察其亞細胞定位,顯示熒光主要集中在細胞漿。 5.應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng),構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-p7TP2,轉(zhuǎn)化酵母細胞AH109,并與轉(zhuǎn)化人肝細胞文庫質(zhì)粒的酵母細胞Y187配合,在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和X-α-gal上進行雙重篩選,測序,并進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示p7TP2蛋白與一些直接和間接與抗凝血因子有關(guān)的蛋白基因具有相互作用,推測p7TP2蛋白可能直接或間接參與抗凝血過程。 6.選取p7TP2基因起始密碼子ATG上游1203bp下游147bp的基因組DNA序列作為啟動子,克隆并構(gòu)建載體pCAT3-p7TP2-p和PGLB-p7TP2-p,應(yīng)用CAT表達系統(tǒng)和雙熒光素酶系統(tǒng)檢測顯示在不同的細胞系HepG2和Huh-7中均具有啟動子活性;共轉(zhuǎn)染試驗顯示HCV p7對p7TP2啟動子活性具有下調(diào)作用。 上述結(jié)論為進一步研究p7TP2基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的線索,也為HCV p7的反式調(diào)節(jié)作用及HCV發(fā)病機制研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

進行 PROF 預(yù)測，并預(yù)測可能為球蛋白，但結(jié)構(gòu)并不是特別緊密。疏水性預(yù)測最大值是 2.422，最小值是-2.289，在 8～32，100～118，基酸具有很強的疏水性，其次是 84～95 的區(qū)域具有一定的疏水性(圖gnalP-信號肽預(yù)測工具預(yù)測該蛋白信號肽概率 0.991，，錨定蛋白概率點概率是 0.471，位于 27 與 28 氨基酸之間(圖 2-7)。進行跨膜結(jié)構(gòu)的分析包括兩個強跨膜螺旋(從 11~27，跨膜方向由跨膜方向由外向內(nèi))(圖 2-8)，無明顯的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。1 MVEVPRHHPC CLLMALGWVL PSWGSLGAVG SPESAWRRWR FGEFGRQAGV51 SCRGPGKGDC DSGSSRAKAx xxxxxxxxxx xTPAHCTLRF QLPGAGEMAE101 PGPWMISVPV PLFPGxxxxx xxxxxxxxWR NTGPNRGCGS KTHTRTRPGA151 ALCSSGPWLG LVVM圖 2-5 x 代表低復(fù)雜性區(qū)域Fig.2-5 x represents low reproducibility regions

圖 2-7 p7TP2 蛋白的信號肽分析Fig.2-7 the signal peptide analysis of p7TP2 protein圖 2-8 p7TP2 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.2-8 the transmembrane structural domain analysis of p7TP2 protein
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346

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本文編號：2547428