【摘要】：目的：1．克隆血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2／KDR)胞外段三區(qū)基因。2．制備具有良好抗原性的人KDR3重組蛋白。3．制備具有生物學(xué)活性的VEGF_(165)重組蛋白。4．制備抗人KDR3單克隆抗體，研究所獲得抗體的相關(guān)生物學(xué)活性。為進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2抗體在腫瘤診斷和治療中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：1．從ECV304細(xì)胞株中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用設(shè)計(jì)合成的人VEGFR-2／KDR胞外段三區(qū)基因的引物，以PCR的方法擴(kuò)增人VEGFR-2／KDR胞外三區(qū)基因，連接到T載體測(cè)序。2．將人VEGFR-2／KDR胞外三區(qū)基因克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α內(nèi)并提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，將鑒定的陽(yáng)性表達(dá)載體質(zhì)粒pET28a(+)-KDR3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用Ni~(2+)-NTA純化，收集洗脫液。3．同KDR3制備方法制備VEGF_(165)。將制備的VEGF165按一定的濃度梯度入加到接種有HUVEC細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，加入MTT，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物A_(570nm)值。4．用重組人KDR3蛋白免疫BALB／c小鼠，取脾B淋巴細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞融合，有限稀釋法篩選、制備單克隆細(xì)胞株。將單克隆細(xì)胞株接種到降植烷致敏的F1代小鼠腹腔，2周后收集腹水，腹水用Protein ASepharose CL-4B柱純化。Western Blot鑒定其抗原的結(jié)合特性，，在VEGF_(165)刺激HUVEC細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中加入純化的抗人KDR3單抗，培養(yǎng)24h，加入MTT，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物A_(570nm)值。 結(jié)果：1．?dāng)U增獲得的人VEGFR-2／KDR胞外三區(qū)基因測(cè)序結(jié)果與genebank中的KDR序列一致。2．構(gòu)建的pET28a(+)-KDR3重組質(zhì)粒雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳見300 bp左右大小的DNA條帶。pET28a(+)-KDR3／BL21(DE3)誘導(dǎo)后有相對(duì)分子質(zhì)量為16 000的蛋白表達(dá)。3．構(gòu)建的pET28a(+)-VEGF_(165)重組質(zhì)粒雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳見約580 bp大小的DNA條帶。pET28a(+)-VEGF_(165)／BL21(DE3)誘導(dǎo)后有相對(duì)分子質(zhì)量為26 000的蛋白表達(dá)。在0.02μg／ml到0.5μg／ml濃度范圍內(nèi)隨著VEGF_(165)濃度的增高，MTT吸光度值相應(yīng)增高。4．純化獲得了4株抗人VEGFR-2／KDR胞外段三區(qū)的單克隆抗體。Western Blot結(jié)果顯示單克隆抗體2C2能與人KDR3特異性結(jié)合。加有單克隆抗體2C2組的MTT吸光度值與未加2C2組比較有顯著性差異。 結(jié)論：1．成功地克隆了人VEGFR-2／KDR胞外三區(qū)基因。2．獲得了具有良好抗原性的人VEGFR-2／KDR胞外段三區(qū)重組蛋白。3．獲得了VEGF_(165)重組蛋白，該蛋白具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。4．獲得4株能分泌抗人KDR3單抗的雜交瘤細(xì)胞株。2C2單抗能抑制VEGF_(165)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步研究抗人KDR3抗體在抗血管新生及腫瘤診斷、治療中的作用奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

KDR3擴(kuò)增片斷電泳圖

2.人KOR3的克隆與測(cè)序測(cè)序結(jié)果與genebank中人KDR基因序列比對(duì)，得到一個(gè)與genebank中的人KDR基因序列一致的陽(yáng)性克隆 pMD18一T一KDR3(見圖3.2)。由于引物設(shè)計(jì)時(shí)已引入酶切位點(diǎn)，所以KDR三區(qū)基因片段兩端分別帶有BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)。4〕 5060703090上0〔全，忿白幻咒.勺弓粼節(jié)生，二今r節(jié)叮兮己扁亡個(gè)勺二心r了予二蓋T心忿敘孟TTI雪盞點(diǎn)巴叮孟爪:丁己了予弓已扁心孟孟孟扁.二二幾萬(wàn)p號(hào)節(jié)士，T孟公JUUJIUJ之UJ‘JL‘J‘UJ’JU二C啟〕介二‘二八GT心(夕二C了G人了二了蛇r二忿尸公二六‘，二入或.二尸公二:人C占飛一l一I，二矛二‘.二.二心甲二二_飛夕二幾畝公;二沈月二了C〔;八90京圖3.2人KDR3基因測(cè)序結(jié)果圖
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2534252