【摘要】： 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是一個(gè)全球性的危害人類健康的重要病原體，感染機(jī)體后極易導(dǎo)致慢性肝炎、并引起肝纖維化、肝硬化、肝壞死，最終導(dǎo)致肝癌。目前對(duì)于丙型肝炎病毒致病機(jī)制的了解仍然非常有限。研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外，病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用在其中發(fā)揮重要作用。在組成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Structural Protein)和非結(jié)構(gòu)蛋白中(Non-structural Protein)，非結(jié)構(gòu)蛋白5A(NS5A)通過與細(xì)胞蛋白的相互作用在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、抗細(xì)胞凋亡以及其它的一些方面發(fā)揮了重要作用，并且許多相互作用的后果都能維持或促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)復(fù)制，但其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步明確。本文以NS5A蛋白為釣餌，通過篩選人胎肝細(xì)胞cDNA基因文庫，尋找與HCV NS5A蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步確認(rèn)NS5A與細(xì)胞蛋白的相互作用并研究其生物學(xué)意義。 首先構(gòu)建了HCV NS5A酵母表達(dá)質(zhì)粒，并利用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)對(duì)人胎肝細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行篩選。通過第一輪篩選初步獲得陽性候選克隆后，將上述克隆再次分別與NS5A釣餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞進(jìn)行第二輪驗(yàn)證，獲得十二個(gè)陽性克隆。測序后通過Blast檢索發(fā)現(xiàn)這十二個(gè)克隆含有兩個(gè)cDNA序列，分別編碼38kD免疫抑制劑FK506結(jié)合蛋白(38kD immunosuppmssant FK506-bindingprotein，F(xiàn)KBP38)和ADP核糖基化樣因子6的作用蛋白(ADP-ribosylation-likefactor-6 interacting protein 1，Aip-1)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，NS5A可以通過不同途徑抑制細(xì)胞凋亡，而FKBP38能通過其跨膜端將Bcl-2抗凋亡家族的兩個(gè)分子Bcl-2和Bcl-xL錨定到線粒體外膜上從而發(fā)揮抗凋亡作用。由此可以推測NS5A與FKBP38的相互作用有可能參與抑制細(xì)胞凋亡，值得作進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步驗(yàn)證NS5A與FKBP38的相互作用，首先通過體外翻譯獲得~(35)S標(biāo)記的NS5A和帶HA標(biāo)簽的FKBP38。免疫共沉淀結(jié)果顯示在HA抗體存在下，NS5A和HA-FKBP38在體外可發(fā)生物理上的結(jié)合。進(jìn)一步構(gòu)建NS5A-myc和HA-FKBP38真核表達(dá)質(zhì)粒并共轉(zhuǎn)Cos7非洲綠猴腎細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是加入myc抗體還是佸抗體，這兩個(gè)蛋白始終在免疫復(fù)合物中被檢測到。進(jìn)一步在HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞的裂解液中，加入上述蛋白抗體也獲得同樣結(jié)果。同時(shí)，通過免疫共沉淀還發(fā)現(xiàn)FK506并不影響上述兩個(gè)蛋白的結(jié)合。然后應(yīng)用免疫熒光和激光共聚焦掃描確認(rèn)兩者在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。結(jié)果顯示無論是瞬時(shí)共轉(zhuǎn)還是在HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中，這兩個(gè)蛋白均存在于胞漿的相同位點(diǎn)。進(jìn)一步利用亞細(xì)胞器特異性染料和標(biāo)志蛋白進(jìn)行激光共聚焦發(fā)現(xiàn)FKBP38定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，而NS5A定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并有部分存在于線粒體。進(jìn)一步運(yùn)用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)和激光共聚焦進(jìn)行突變體分析，，發(fā)現(xiàn)NS5A的148-236位氨基酸參與了和FKBP38的相互作用，且這一片斷包含一個(gè)Bcl-2同源區(qū)；而FKBP38的跨膜區(qū)對(duì)它與NS5A的結(jié)合也至關(guān)重要。上述結(jié)果證明NS5A和FKBP38之間存在直接的相互作用。 為研究NS5A與FKBP38相互作用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，建立了表達(dá)NS5A的Huh7-NS5A穩(wěn)定細(xì)胞株。利用該細(xì)胞株和HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞都能抑制凋亡誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡；當(dāng)用siRNA干擾技術(shù)抑制HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中的NS5A后，復(fù)制子細(xì)胞部分恢復(fù)凋亡敏感性，提示NS5A具有抗凋亡活性。另一方面，利用siRNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)源性FKBP38表達(dá)后發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞部分恢復(fù)對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感，而對(duì)照細(xì)胞無明顯差異，提示NS5A的這種抗凋亡活性依賴于FKBP38。在Huh7-NS5A穩(wěn)定細(xì)胞株中通過siRNA干擾FKBP38后檢測凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)凋亡后PARP剪切體的量，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細(xì)胞株中被剪切的PARP量明顯較少，說明NS5A的抗凋亡作用可能是通過穩(wěn)定線粒體的方式實(shí)現(xiàn)。鑒于Bcl-2在Huh7細(xì)胞中缺如，以上結(jié)果提示在Huh7細(xì)胞中NS5A可能發(fā)揮類似抗凋亡分子Bcl-2的作用，并且這種作用可能是通過FKBP38實(shí)現(xiàn)。 綜上所述，本文應(yīng)用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)以HCV NS5A為誘餌對(duì)人胎肝cDNA文庫進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)FKBP38是NS5A的相互作用蛋白．在確認(rèn)NS5A與FKBP38相互作用的基礎(chǔ)上，研究了這種相互作用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)了NS5A抑制細(xì)胞凋亡可通過FKBP38所介導(dǎo)，提出了NS5A抑制細(xì)胞凋亡一種新的途徑，豐富了對(duì)NS5A抗凋亡機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步研究病毒蛋白與細(xì)胞蛋白之間的相互作用，闡明HCV的致病機(jī)制打下了良好基礎(chǔ)。
【圖文】：

/X一a一Gal(20ug/ml)平板上僅PGBKT7一NSSA與pACTZ一FKBP38的共轉(zhuǎn)化子及陽性對(duì)照組可見藍(lán)色菌落，其它空載體及陰性對(duì)照組均不變藍(lán)，也無明顯生長跡象(圖1.3.)。說明NSSA或FKBP38的單獨(dú)表達(dá)都無法激活酵母報(bào)道基因的表達(dá)，報(bào)道基因的激活依賴于Ns5A與FKBP38的相互作用。SD/一TrP一 LeuSD/一Trp一Leu一His一Ade/3一AT圖1.2.酵母轉(zhuǎn)化生長實(shí)驗(yàn)兩圖中從上至下六組菌落依次為下列共轉(zhuǎn)化子 :(1)pGBKT7+pAcTZ;(2)pGBKT7一NSSA+pACTZ一FKBP38:(3)PGBKT7一 NSSA+PACTZ;(4)pGBKT7+pACTZ一FKBp38;(5)陽性對(duì)照:pGBKT7一p53+pGADT7一T;(6)陰性對(duì)照:pGBKT7一lam+pGADT7一T

Ns5A與細(xì)胞蛋白FKBP38相互作用的確認(rèn)及胞中NSSA和內(nèi)源性的FKBP38是否在HCV感染的生理情況下同基因組復(fù)制子細(xì)胞作為研究對(duì)象DNA3艦A一FKBP38，轉(zhuǎn)染48小時(shí)小鼠正常血清)沉淀免疫復(fù)合物，顯示，內(nèi)源性的Ns5A與過表達(dá)的HCVRePlicon細(xì)胞裂解液作免性的FKBP38同樣存在直接的相下NSSA可以和FKBP38發(fā)生相InPut
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R373

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2529015