【摘要】：目的:通過雜交瘤技術(shù),制備出鼠抗人IgG單克隆抗體,并將其運用到結(jié)核抗體IgG檢測試紙條中,研制出能快速靈敏的檢測出結(jié)核抗體IgG的檢測試紙條。方法:用人IgG作為抗原免疫Balb/c小白鼠,經(jīng)四次免疫后,測Balb/c小白鼠的血清效價。取效價最高的一只用其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,促融劑為分子量為1000的PEG。用間接ELISA方法檢測出陽性雜交瘤細(xì)胞株,用有限稀釋法對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆,亞類鑒定用試劑盒進(jìn)行鑒定,用間接ELISA法測定抗體腹水效價。用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液,并制備了穩(wěn)定的金標(biāo)記1E1抗體,將其浸膜后裝備成試紙條。 結(jié)果:用雜交瘤技術(shù)制備出了十一株能穩(wěn)定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為5A8、3C10、5E3、1E1、1D1、1E2、1E3、1G3、2D2、1C12、5B11。亞類鑒定結(jié)果為:5A8、5E3、5B11、1D1、1E2、1E3、1G3、3C10均為IgG1,1E1為IgG2a,2D2為IgG2b,1C12為IgM。染色體計數(shù)結(jié)果為96-107,染色體計數(shù)分析均為Ba1b/c小白鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞。取其中四株腹水效價達(dá)到3.9×10~(-7)的5A8、3C10、5E3、1E1進(jìn)行親和力測定,親和力系數(shù)均達(dá)到10~7。用鹽析法進(jìn)行粗提后,用凝膠過濾法進(jìn)行進(jìn)一步的純化并用SDS-PAGE電泳鑒定純化結(jié)果。用這四株純化的抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記,只有1E1金標(biāo)記抗體能穩(wěn)定。將金標(biāo)記1E1抗體浸無紡布,用重組結(jié)核抗原標(biāo)記檢測線,以羊抗鼠IgG抗體標(biāo)記控制線,制備出檢測結(jié)核抗體IgG的檢測試紙條。檢測含有結(jié)核抗體IgG的陽性溶液和生理鹽水等陰性溶液,實驗結(jié)果良好。 結(jié)論:本研究制備出了十一株鼠抗人IgG單克隆抗體,并且初步研制出了檢測結(jié)核抗體IgG的免疫層析試紙條。為結(jié)核病的檢測和預(yù)防做了非常有意義的嘗試。
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圖片說明： 經(jīng)免疫后的Balb/c小白鼠的脾細(xì)胞和提前擴(kuò)大培養(yǎng)的Balb/c小白鼠SPZ/0骨髓瘤細(xì)胞用PEG1000融合后，，經(jīng)過選擇性培養(yǎng)基HAT培養(yǎng)液的選擇性培養(yǎng)，融合后在電子顯微鏡下觀察，在第d3開始出現(xiàn)融合細(xì)胞克隆(如圖1)。融合的六板576孔均有雜交瘤細(xì)胞克隆生長，融合率為100%。經(jīng)兩次間接EUSA方法檢測，有40孔雜交瘤細(xì)胞生長孔上清內(nèi)的抗體反應(yīng)表現(xiàn)陽性。選擇其中OD值較大的15孔雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆培養(yǎng)(如圖2)。再經(jīng)過3一5次亞克隆，直至陽性克隆率達(dá)到100%。獲得十一株穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株十一株，分別命名為:3C10、5E3、5Bll、IDI、IEZ、IE3、IG3、IEI、5A8、2D2、IC12。圖1:一個生長初期的雜交瘤細(xì)胞克隆口Zoox)Figl:OnehbyridomaeelleloneofinitialPhase(3200x)圖2:一個生長后期的雜交瘤細(xì)胞克隆口Zoox)FigZ:OnehybridomaeellcloneoflatePhase(32X()x)
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圖片說明： 雜交瘤細(xì)胞克隆生長，融合率為100%。經(jīng)兩次間接EUSA方法檢測，有40孔雜交瘤細(xì)胞生長孔上清內(nèi)的抗體反應(yīng)表現(xiàn)陽性。選擇其中OD值較大的15孔雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆培養(yǎng)(如圖2)。再經(jīng)過3一5次亞克隆，直至陽性克隆率達(dá)到100%。獲得十一株穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株十一株，分別命名為:3C10、5E3、5Bll、IDI、IEZ、IE3、IG3、IEI、5A8、2D2、IC12。圖1:一個生長初期的雜交瘤細(xì)胞克隆口Zoox)Figl:OnehbyridomaeelleloneofinitialPhase(3200x)圖2:一個生長后期的雜交瘤細(xì)胞克隆口Zoox)FigZ:OnehybridomaeellcloneoflatePhase(32X()x)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2515354