發(fā)布時間：2019-05-16 05:08

【摘要】： 目的:研究人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在體外可以增殖性感染鼠胚成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast,MF),探討HCMV體外增殖性感染MF細(xì)胞與感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)的相關(guān)性,為HCMV跨種屬感染的分子機(jī)制研究奠定實驗基礎(chǔ)。 方法:HCMV AD169毒株復(fù)蘇感染人胚成纖維細(xì)胞(human embryo fibroblast,HF),連續(xù)傳代三次,待細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect ,CPE)達(dá)“4+”時,反復(fù)吹打使病毒釋放,4℃3 000 rpm離心10 min,收獲上清;部分上清作PFU試驗測定病毒滴度,其余凍存于-80℃冰箱;設(shè)定MOI為0.1、1、10和100,根據(jù)測定出的病毒滴度和細(xì)胞計數(shù),算出各MOI所需病毒量,分別接種至6孔培養(yǎng)板對應(yīng)的MF細(xì)胞和HF細(xì)胞上,置5% CO2溫箱37℃培養(yǎng),次日換維持液,逐日鏡下觀察HCMV特征性CPE;分別在第1、2、5、7、10和14 d收集細(xì)胞和培養(yǎng)物上清,進(jìn)行下列各項實驗:(1)培養(yǎng)物上清采用PFU試驗檢測其中的病毒滴度;(2)收集的細(xì)胞用于進(jìn)行RT-PCR半定量檢測HCMV IE和UL83基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;(3)第14 d后的細(xì)胞培養(yǎng)物用于抽提DNA基因組,行PCR檢測HCMV UL83基因驗證病毒;(4)采用透射電鏡觀察不同MOI感染的MF和HF細(xì)胞內(nèi)有無皰疹病毒樣病毒顆粒形態(tài)特征,在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位以及感染的MF和HF細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化與MOI的關(guān)系。 結(jié)果:以MOI為0.1和1感染MF和HF細(xì)胞時,MF細(xì)胞在2周的培養(yǎng)過程中沒有觀察到CPE的產(chǎn)生,HF細(xì)胞分別在第10 d和第7 d出現(xiàn)了較為明顯的特征性CPE,光鏡下觀察可見部分細(xì)胞腫脹、變圓、折光性增強(qiáng)等特征;以MOI為10和100感染MF和HF細(xì)胞時,MF細(xì)胞分別在第7 d和第5 d出現(xiàn)了明顯的特征性CPE,HF細(xì)胞分別在第5 d和第3 d出現(xiàn)了明顯的特征性CPE,光鏡下所見同前。隨著時間的延長,細(xì)胞病變明顯加重,顆粒狀物越來越多,CPE擴(kuò)展至整個單層細(xì)胞。MOI為0.1和1感染MF細(xì)胞后各時間點的培養(yǎng)物上清經(jīng)PFU試驗測定,均在第1和2 d的取樣中檢測到病毒的滴度很低,其他5個時間點未檢測到空斑形成。MOI為10和100感染MF細(xì)胞后各時間點的培養(yǎng)物PFU測定結(jié)果顯示:MOI為100時感染MF細(xì)胞,第1 d培養(yǎng)物上清中病毒滴度為5.8×101PFUs/ml,第2 d病毒滴度增高到1.5×102 PFUs/ml,在感染的第5 d病毒度的滴度高達(dá)2.1×105 PFUs/ml,等到感染的第10 d時,病毒的滴度達(dá)到了高峰,為1.2×107 PFUs/ml,接下來隨著病變細(xì)胞的死亡病毒滴度開始下降,到第14 d病變細(xì)胞完全脫落死亡時,病毒滴度降為3.4×105 PFUs/ml,這與在鏡下觀察到出現(xiàn)特征性CPE的時間基本一致。MOI為10時病毒滴度的變化趨勢和MOI為100時基本一致,但MOI為10時,在第14 d時MF病變細(xì)胞并沒有完全死亡脫落。而與MF平行設(shè)置的HF細(xì)胞對照中,四個MOI中PFU試驗均可檢測到空斑的形成且病毒滴度隨時間的延長逐漸增高,直到病變細(xì)胞死亡后病毒滴定開始下降;MOI為10和100時,病毒滴度的遞增趨勢與HF平行對照中檢測的結(jié)果相類似。本研究中,對四個MOI第14 d后的培養(yǎng)物用PCR進(jìn)行了驗證,MOI為0.1,1,10和100時均可在766bp處擴(kuò)增出HCMV UL83基因的特異性條帶。RT-PCR半定量檢測結(jié)果顯示:MOI為0.1和1時,未檢測到HCMV IE和UL83 mRNA的轉(zhuǎn)錄;而MOI為10和100時均檢測到了HCMV IE和UL83 mRNA的轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄水平隨著時間的推移呈遞增趨勢,直逐漸達(dá)高峰,隨后呈下降趨勢。透射電鏡觀察結(jié)果:在MOI為0.1和1時,電鏡觀察MF細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外未見皰疹樣病毒顆粒;而MOI為10和100時,在透射電鏡下可見MF細(xì)胞內(nèi)有皰疹樣病毒顆粒存在。 結(jié)論:(1)本研究通過PFU試驗準(zhǔn)確測定感染HCMV后MF細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的病毒滴度,證明了HCMV可以在體外培養(yǎng)的MF細(xì)胞上增殖性感染;(2)以不同MOI感染MF細(xì)胞,通過PFU試驗測定和分子生物學(xué)水平的檢測,確定了增殖性感染與病毒MOI存在正相關(guān)性。
[Abstract]:Objective: To study the relationship between human cytomegalovirus (HCMV) and human cytomegalovirus (MF) in vitro. The experimental basis was laid for the study of molecular mechanism of HCMV cross-species infection. Methods: The human embryonic fibroblasts (HF), which were infected by HCMV AD169, were serially passaged for three times. When the cytopathogenic effect (CPE) reached the "4 +", the virus was released and centrifuged at 3 000 rpm at 4 鈩，

本文編號：2478038