【摘要】：研究背景： 甲基苯丙胺(Methamphetamine，MA)是一種新出現(xiàn)的毒品類型。近年來，MA的濫用人數(shù)不斷上升，全球濫用人數(shù)僅次于大麻，成為危害最為嚴重和廣泛的毒品之一。MA屬于苯丙胺類興奮劑，具有多種藥理、毒理學特性。近年來的研究顯示，MA有較強的神經(jīng)毒性，可導致大腦出現(xiàn)與阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性病變相類似的改變，主要表現(xiàn)為腦組織多巴胺水平下降、多巴胺能神經(jīng)軸索受損、酪氨酸羥化酶(TH)活性降低、多巴胺攝取位點(DA uptake sites)和單胺遞質(zhì)轉(zhuǎn)運小泡(versicular monoamine transporters，VMAT-2)濃度下降、神經(jīng)細胞凋亡。MA的神經(jīng)毒性是一個多途徑、多機制參與的過程，研究顯示，氧化應激損傷作用、體溫平衡失調(diào)、離子穩(wěn)態(tài)破壞以及細胞凋亡相關(guān)通路的激活是MA神經(jīng)毒性的可能機制；但現(xiàn)有的研究結(jié)果不足以充分闡釋MA的神經(jīng)毒性機制，目前對其毒性尚缺乏有效的的防治手段。 目的： 建立MA中毒動物模型，運用病理學、行為學、神經(jīng)化學等方法，全面了解MA毒性作用；在此基礎(chǔ)上，運用比較蛋白質(zhì)組學方法，篩查腦組織中與MA毒性作用密切相關(guān)的差異表達蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白質(zhì)的功能，探討MA的神經(jīng)毒性機制。并根據(jù)研究結(jié)果，選擇有意義的通路，作進一步研究。方法： 1．MA中毒動物模型的建立和毒性觀察 Wistar大鼠40只，隨機分為實驗組和對照組。動物腹腔注射MA，劑量為15 mg／kg體質(zhì)量，每天早8：00點、晚6：00點各注射一次，連續(xù)注射4天，共8次，制成MA中毒動物模型。觀察動物的行為變化，體重、進食量、飲水量的變化和心、肝、脾、肺、腎等主要臟器的組織學變化；高效液相色譜檢測紋狀體、海馬、額葉皮質(zhì)等部位腦組織多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量；HE染色、Glees氏銀浸染觀察腦組織病理變化；GFAP免疫組化染色檢測星形膠質(zhì)細胞增生情況。 2．甲基苯丙胺神經(jīng)毒性機制的比較蛋白質(zhì)組學研究 采用雙相電泳技術(shù)分離MA中毒大鼠和正常對照大鼠紋狀體、海馬、額葉皮質(zhì)腦區(qū)蛋白質(zhì)，篩選差異表達的蛋白質(zhì)點，進行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，根據(jù)蛋白質(zhì)的相關(guān)功能，探討MA的神經(jīng)毒性機制。 3．氧化應激過程中NOS／NO在MA神經(jīng)毒性機制中的作用研究 根據(jù)上一部分的研究結(jié)果，MA導致氧化應激過程中，可能通過NOS活性的增高和產(chǎn)生過量NO導致神經(jīng)毒性作用。本研究首先觀察MA對腦組織NOS活性的影響，其次應用nNOS特異性的抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)，研究nNOS活性變化與MA神經(jīng)毒性的關(guān)系。Wistar大鼠16只，隨機分為生理鹽水組、7-NI組、MA組、7-NI+MA組；用化學顯色法檢測生理鹽水組和MA組大鼠紋狀體NOS活性，測量各組大鼠體溫變化和紋狀體DA含量變化。 4．MA神經(jīng)毒性相關(guān)硝化靶蛋白質(zhì)的鑒定 應用雙向電泳分離蛋白質(zhì)結(jié)合western blot 3-硝基酪氨酸免疫顯色(two-dementional 3-NT blot)技術(shù)，檢測大鼠紋狀體組織中硝化的蛋白質(zhì)點，用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定硝化蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白質(zhì)的功能，進一步深入探討MA導致NO生成過量的神經(jīng)毒性機制。 結(jié)果1．MA注射后動物進食量明顯減少(P＜0.001)，具有明顯的食欲抑制作用，并可導致動物體重下降(P＜0.001)；MA導致動物出現(xiàn)明顯的行為改變，主要表現(xiàn)為好動、易激惹等，動物刻板行為評分明顯高于對照組(P＜0.001)。紋狀體、海馬、額葉皮質(zhì)腦組織多巴胺含量下降(P＜0.001)，紋狀體DOPAC／DA比值增高(t=5.133，P=0.045)。紋狀體神經(jīng)細胞周圍水腫、神經(jīng)元變性、軸索損傷，紋狀體、海馬膠質(zhì)細胞增生。部分動物肝細胞水腫、脂肪變，肺間質(zhì)充血，炎細胞浸潤。 2．通過比較蛋白質(zhì)組學分析，分別在紋狀體發(fā)現(xiàn)14個、海馬12個、額葉皮質(zhì)4個差異表達蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)分別與氧化應激、蛋白酶體功能、神經(jīng)退行性變／凋亡和線粒體功能失調(diào)有關(guān)。三個腦區(qū)差異蛋白譜的變化各不相同，但部分蛋白質(zhì)在兩個或三個腦區(qū)同時表達上調(diào)或下調(diào)。 3．MA注射組紋狀體NOS活性顯著高于生理鹽水組(P=0.001)；7-NI不影響動物的體溫，對MA導致的動物體溫升高亦無降溫作用(P＞0.05)；7-NI+MA組紋狀體DA含量顯著高于MA組(P＜0.001)。 4．應用雙向電泳分離蛋白質(zhì)結(jié)合western blot 3-硝基酪氨酸免疫顯色(two-dimensional 3-NT blot)技術(shù)，在大鼠紋狀體組織中發(fā)現(xiàn)6個硝化蛋白質(zhì)點，其中5個在MA作用后硝化增強；通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定出3個蛋白質(zhì)：tropomodulin1，tropomodolin 2和mu-crystallin。其中前兩個蛋白質(zhì)是原肌球調(diào)節(jié)蛋白(tropomodulin，TMOD)的兩種功能相似的亞型。TMOD通過與肌動蛋白結(jié)合，參與維持細胞骨架穩(wěn)定性。mu-crystallin的功能尚未完全明了，可能參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的分化成熟和氧化應激過程。 結(jié)論 1．MA具有明顯的神經(jīng)毒性作用，可造成紋狀體、海馬、額葉皮質(zhì)等多腦區(qū)損傷和動物行為改變，并對肝、肺等器官有一定毒性作用。 2．氧化應激、蛋白酶體功能異常、神經(jīng)退行性變／凋亡、線粒體功能失調(diào)是MA神經(jīng)毒性的主要機制；MA可通過相似的毒性損傷機制，對不同腦區(qū)產(chǎn)生毒性損傷作用。 3．MA導致氧化應激過程中腦組織NOS活性增高，，以及NO的過量生成，是MA神經(jīng)毒性的重要機制。 4．MA導致原肌球調(diào)節(jié)蛋白(tropomodulin)硝化后功能喪失，破壞神經(jīng)元正常細胞骨架，可導致神經(jīng)軸索損傷、神經(jīng)細胞凋亡，并且可能與動物行為改變有關(guān)。腦組織NOS活性增高，NO的過量生成，導致神經(jīng)細胞中重要結(jié)構(gòu)蛋白的硝化損傷，是MA神經(jīng)毒性的重要機制。
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【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R341

【引證文獻】

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1 姜祥智;青島市吸冰者人格特點與心理健康的相關(guān)分析[D];蘇州大學;2011年

本文編號：2467958